豬細(xì)小病毒病—豬圓環(huán)病毒病二聯(lián)滅活疫苗的研究.pdf

1、豬細(xì)小病毒病(Porcine parvovirus disease)和豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus disease)均是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病，分別是由豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)和豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)感染引起的，這兩種疾病廣泛存在于世界各地并在大多數(shù)種豬場(chǎng)流行，嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前，疫苗接種是有效防控這兩種重要傳染病的

2、主要措施，但是僅用單苗費(fèi)時(shí)費(fèi)力、應(yīng)激大，存在免疫漏洞，人們迫切需要“一針防兩病”的高效二聯(lián)滅活疫苗，鑒于此，本研究經(jīng)過(guò)免疫原性試驗(yàn)、免疫保護(hù)性試驗(yàn)等最終篩選出1株P(guān)CV2疫苗候選株。為了克服PCV2體外繁殖能力差，增殖滴度低的缺點(diǎn)，并初步探討利用轉(zhuǎn)管微載體培養(yǎng)PK-15細(xì)胞生產(chǎn)PCV2，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)篩選到的PPV疫苗候選株HNZK株成功制備出豬細(xì)小病毒病和豬圓環(huán)病毒病二聯(lián)滅活疫苗，主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1、為篩選

3、出滿足PCV2滅活疫苗制苗要求的毒株，選擇本實(shí)驗(yàn)室分離保存的8株P(guān)CV2分離株進(jìn)行免疫原性分析。結(jié)果顯示，8株P(guān)CV2分離株中HNTP和HNYY分離株病毒培養(yǎng)原液制備的滅活疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平較高，二免后一周抗體水平即高于1∶800，達(dá)到PCV2滅活疫苗的國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，三周時(shí)達(dá)到峰值1∶3200，比對(duì)照商品疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平(1∶1600)更高;其分別稀釋130倍和463倍后制備的疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平在二免后三周也

4、能達(dá)到1∶800。由以上結(jié)果可知，PCV2 HNTP和HNYY分離株毒價(jià)高，免疫效力良好，是理想的疫苗候選株。本研究豐富了PCV2滅活疫苗毒株的種毒資源，為研制高質(zhì)量的PCV2疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　2、為了研究PCV2疫苗候選株（HNTP和HNYY株）制備的疫苗的免疫保護(hù)作用，對(duì)二免四周后的小鼠分別攻不同劑量的PCV2，通過(guò)臨床癥狀觀察和小鼠組織中病毒載量檢測(cè)，來(lái)評(píng)價(jià)本研究所制備疫苗對(duì)不同劑量攻毒的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，免疫組小鼠組

5、織中各攻毒組中均未檢測(cè)到病毒，說(shuō)明疫苗起到了保護(hù)作用，且HNYY株制備疫苗產(chǎn)生的抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，因此后期疫苗制備選用HNYY株。對(duì)照組中接受6.072×106copies，6.072×107copies攻毒劑量的小鼠組織中均檢測(cè)到病毒，說(shuō)明病毒在小鼠體內(nèi)復(fù)制，并在心、肝、肺、淋巴結(jié)中病毒含量相對(duì)較高。
　　3、為了克服PCV2體外繁殖能力差，增殖滴度低的缺點(diǎn)，作者利用微載體貼壁細(xì)胞具有高比表面積、細(xì)胞產(chǎn)量高、便于監(jiān)測(cè)、控制和取樣，

6、生產(chǎn)規(guī)模容易放大，不易污染等優(yōu)點(diǎn)，初步探討利用轉(zhuǎn)管微載體培養(yǎng)PK-15細(xì)胞生產(chǎn)PCV2。結(jié)果顯示，相同培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)管培養(yǎng)PK-15細(xì)胞數(shù)是普通方瓶培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的10倍左右，接毒120.8MOI組在接毒后100h時(shí)病毒含量基本達(dá)到最高5.53E+06copies/μL，可以提高病毒滴度1.65倍左右。以上結(jié)果說(shuō)明利用微載體培養(yǎng)PK-15細(xì)胞生產(chǎn)PCV2是可行的，為提高病毒增殖滴度和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)高效價(jià)疫苗抗原提供了技術(shù)依據(jù)。
　　4、

7、利用篩選出的PCV2 HNYY毒株和實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的PPV HNZK株分別制備病毒液，經(jīng)透析袋濃縮法制備高滴度的兩種病毒液作為制備二聯(lián)滅活疫苗的抗原，收集病毒液進(jìn)行甲醛滅活，將上述兩種滅活病毒液等體積混合后加入油佐劑乳化制成豬細(xì)小病毒病-豬圓環(huán)病毒病二聯(lián)滅活疫苗，并在進(jìn)行了疫苗的物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)后，進(jìn)行了安全性及動(dòng)物免疫試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該二聯(lián)滅活疫苗對(duì)動(dòng)物安全可靠，免疫小鼠后，二聯(lián)疫苗于二免后二周PCV2ELISA抗體水平達(dá)到高峰(1