豬圓環(huán)病毒病防控分析

1、2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),1,豬圓環(huán)病毒病防控措施,何啟蓋 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疫病防控崗位科學(xué)家,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),2,獸醫(yī)科學(xué)研究的基本思路,基礎(chǔ)研究：提供新理論和新概念，合成新材料：如病原結(jié)構(gòu)、分類、入侵細(xì)胞、與宿主互作，致病機(jī)理等應(yīng)用基礎(chǔ)研究 （1）研制新型基因工程疫苗、診斷試劑盒、藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)、抗微生物制劑篩選等 （2）以臨床需要為導(dǎo)向，圍

2、繞復(fù)雜的臨床現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)原因，尋找解決方法。應(yīng)用研究 臨床觀察、收集數(shù)據(jù)、分析等 制定新規(guī)程和標(biāo)準(zhǔn)等,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),3,我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)指標(biāo)的差異,2011年統(tǒng)計(jì)，我國(guó)母豬數(shù)量4700萬(wàn)頭左右，母豬年提供出欄豬是14-15頭左右。散養(yǎng)戶較差的生產(chǎn)成績(jī)降低了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的整體效益。 如果全群成活率達(dá)到90%以上，那么不同日齡階段的成活率指標(biāo)分別是：哺乳：96%，保育：97%，育肥：98%

3、-99%。,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),4,國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)性能差距原因的分析,雖然母豬產(chǎn)仔數(shù)相當(dāng)，但配種分娩率低（85%）：繁殖障礙問(wèn)題（傳染病與飼料根源）。產(chǎn)房仔豬：腹瀉問(wèn)題保育豬與生長(zhǎng)豬：殘次率高育肥豬：呼吸道問(wèn)題（綜合癥）,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),5,保育階段豬的主要問(wèn)題：,斷奶后發(fā)熱（40－41℃）消瘦皮膚蒼白關(guān)節(jié)腫大呼吸道癥狀殘次率高，成活率低（50％－85％）,2013-1

4、1-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),6,保育豬問(wèn)題的根源,疾病威脅（1）母源抗體消失（2）病原乘虛而入：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；豬2型圓環(huán)病毒；副豬嗜血桿菌；鏈球菌管理因素：斷奶和混群應(yīng)激；飼料的轉(zhuǎn)換；密度增加,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),7,1、病原學(xué) （病毒的特點(diǎn)）2、流行病學(xué)（如何傳播）3、致病機(jī)制（如何致?。?、臨床癥狀（有哪些表現(xiàn)）5、診斷6. 疫苗研究7、預(yù)防控制措施8. 需要解決的科學(xué)問(wèn)

5、題,豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病Porcine circovirus-associated diseases,相關(guān)臨床表現(xiàn)：仔豬斷奶衰竭綜合征皮炎腎病綜合征繁殖障礙增生性腸炎先天性震顫急性肺臟水腫（Acute pulmonary edema）,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),8,我們?cè)谪i圓環(huán)病毒病研究的歷史,2000年，陳院士獲得第一個(gè)由國(guó)家資助豬圓環(huán)病毒病研究的課題-國(guó)家自然科學(xué)基金課題（30170701），開(kāi)展感染

6、性克隆和病毒基因功能、偽狂犬病-2型圓環(huán)病毒基因工程疫苗研究。2007年：分離出豬2型圓環(huán)病毒W(wǎng)H株和其他毒株。2007年-：國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目資助。2012年7月，獲得新獸藥注冊(cè)證書(shū)-現(xiàn)在-將來(lái)：臨床應(yīng)用技術(shù)的集成。,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),9,1、動(dòng)物和人類的圓環(huán)病毒,植物：椰樹(shù)葉腐爛病毒、三葉草侏儒病毒和香蕉簇頂病毒。禽類：鸚鵡喙羽病毒、鴿圓環(huán)病毒、金絲雀圓環(huán)病毒、鵝圓環(huán)病毒。雞傳染性貧血病毒

7、()；人類：美國(guó)在人輪狀病毒疫苗中發(fā)現(xiàn)類圓環(huán)病毒；輸血傳播病毒（TTV），TTV-like minivirus 豬圓環(huán)病毒起源：由植物矮縮病毒（plant nanovirus)和脊椎動(dòng)物杯狀病毒重組產(chǎn)生（Gibbs and Weiller,1999）,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),10,豬圓環(huán)病毒分類,分為PCV1和PCV2型等。基因組1.7kb，是目前發(fā)現(xiàn)最小的脊椎動(dòng)物DNA病毒。 PCV1目

8、前為止尚未證明致病性。 PCV2存在于多個(gè)組織，有致病性。1965年：血清中發(fā)現(xiàn)PCV2病毒；1991年第一個(gè)圓環(huán)病毒病案例報(bào)道。1998年分離出病毒。,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),11,PCV2 特點(diǎn),無(wú)囊膜，單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA，基因組大小為1767(PCV2b)-1768bp(PCV2a)能在PK－15細(xì)胞生長(zhǎng)，但無(wú)肉眼可見(jiàn)的病變；其生長(zhǎng)依賴細(xì)胞周期S期表達(dá)的細(xì)胞蛋白。用D－氨基葡萄糖處理感染細(xì)胞，可

9、促進(jìn)病毒的增殖。,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),12,豬2型圓環(huán)病毒基因組雖然小，但危害大,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),13,豬2型圓環(huán)病毒主要基因的功能,ORF1：編碼聚合酶，與病毒復(fù)制有關(guān)ORF2：免疫原性基因和毒力相關(guān)基因 很多基因工程疫苗或亞單位疫苗使用的靶基因。如表達(dá)ORF2的重組偽狂犬病毒、重組沙門氏菌、重組波氏桿菌等。ORF3：引起細(xì)胞凋亡ORF4：負(fù)調(diào)控病毒的生長(zhǎng)其它6個(gè)O

10、RF的功能未知,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),14,PCV2 毒株之間ORF2的比較,B.R. Trible, R.R.R. Rowland / Virus Research 164 (2012) 68– 77,受體結(jié)合區(qū),,誘餌表位區(qū),,抗體結(jié)合區(qū),,ORF2與病毒毒力的關(guān)系,兩個(gè)氨基酸突變：P110A（傳代30代，脯氨酸P變?yōu)楸彼幔?和R191S （傳代120代 ，精氨酸變?yōu)榻z氨酸）：增殖滴度增加，毒力增強(qiáng)；基因

11、組中1331-1339bp（ gctgtggcc ，位于ORF2基因（1033～1734bp）中）序列差異 （ Krakowka S, ，Virus.Res. 2012，164:90–99 ）:蛋白構(gòu)象改變-疏水變?yōu)橛H水；,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),15,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),16,PCV2感染降低活疫苗免疫效果,1. Oppressing T, McKeown NE, Harmon KL,

12、Meng XJ, Halbur PG. Clin Vaccine Immunol. 2006 Aug;13(8):923-9. PCV 2感染降低了藍(lán)耳病活病毒疫苗的功效 另一方面，藍(lán)耳病毒感染后，促進(jìn)圓環(huán)病毒在體內(nèi)的增殖和分布（G.M Allan et al., 2000） 2. Huang YL, Pang VF, Lin CM, Tsai YC, Chia MY, Deng MC, Chang CY, Je

13、ng CR. Vet Res. 2011 Dec 1;42(1):115. PCV 2感染降低了減毒豬瘟疫苗的功效 3. 影響偽狂犬病活疫苗的再次免疫應(yīng)答。Kekarainen(2008)：元兇是PCV2 ORF1中的CpG基序,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),17,豬2型圓環(huán)病毒研究的瓶頸問(wèn)題-病毒分離的影響因素,PCV1污染，干擾PCV2的分離細(xì)胞無(wú)病變，很難確定是否感染；不同毒株對(duì)細(xì)胞適應(yīng)性有

14、差異,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),18,豬圓環(huán)病毒2型WH株的分離,PCR陽(yáng)性病料接種細(xì)胞，在第5、10、15、20 代細(xì)胞培養(yǎng)物中，通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)( IFA) 、普通PCR、熒光定量PCR鑒定均為PCV2陽(yáng)性,于第20代后毒價(jià)顯著升高。,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),19,PCV2-WH株分離鑒定,熒光定量PCR鑒定，分離毒株(WH株)拷貝數(shù)為5.84×108/0.1µg,2

15、013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),20,PCV2-WH株基因組序列,GenBank 登錄號(hào)為FJ598044 PCV2-WH株基因組為PCV2b,此外，也分離了9株圓環(huán)病毒,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),21,我國(guó)流行毒株為PCV2b,235 ORF2－PCR為陽(yáng)性的病料中， 9株為PCV2 2a基因型 133份為PCV2 2b基因型 98份：為非2a和2b，推測(cè)為2c（丹

16、麥存在）PCV2b毒力高于PCV2a基因型呈地方分布特征同一個(gè)豬場(chǎng)有PCV2a和2b同時(shí)存在,采用：ORF2 和全基因組測(cè)序；區(qū)分不同基因型的PCR等方法,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),22,分離毒株接種豬的皮炎病例-分離出新的基因型毒株，PCV2d;,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),23,新的病毒基因型不斷出現(xiàn),臺(tái)灣： 2001-2003：PCV2a: 22.9% 2003-2011

17、: PCV2b: 77.1% 我國(guó)大陸（2012年） PCV2b-1C (2a和2b的ORF2之間重組)； PCV2d; PCV2b變異株（2a的ORF1 與2b的ORF2重組）,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),24,2、流行病學(xué)特征,哪些因素與疾病的發(fā)生有關(guān)？,國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目資助,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),25,流行規(guī)律,傳染

18、源傳播途徑易感動(dòng)物其它誘發(fā)因素（X因子）共感染因子,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),26,2-1 傳染源與傳播途徑,病豬的糞尿、鼻腔能排毒；帶毒公豬的精液（檢測(cè)到3-4log10核酸/ml精液）感染后5天可檢測(cè)到。間歇排毒51天（PCV2a)和81天（PCV2b)。垂直傳播：繁殖障礙病乳汁帶毒(Madson et al., 2009; Gerber et al.,2011).發(fā)熱期豬的血清（全血）中可檢測(cè)到

19、病毒蚊子傳播,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),27,2-2易感動(dòng)物,不同年齡的豬均可感染：胎兒，哺乳舍的小豬等感染后較為嚴(yán)重。日齡越小，癥狀越嚴(yán)重。 Catherine： 1－7日齡；無(wú)母乳。需要大量的病毒（接種量為≥107.0TCID50）其它動(dòng)物：小鼠為模型,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),28,2-3 其它因子的參與,傳染性因子 協(xié)同作用：細(xì)小病毒（復(fù)制病例） 促進(jìn)作用：肺炎

20、支原體感染； 豬繁殖與呼吸綜合征病毒非傳染性因子 應(yīng)激：多次注射（疫苗，藥物）。X因子：其它未知因子（？？）,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),29,PCV2和PRRSV與HPS, 鏈球菌的混合感染,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),30,3、致病機(jī)理,損害免疫系統(tǒng)，降低機(jī)體免疫力是新的免疫抑制病之一（藍(lán)耳病、霉菌毒素中毒、豬偽狂犬病，豬支原體肺炎）,國(guó)家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技

21、術(shù)體系項(xiàng)目資助,主要病理特征-淋巴細(xì)胞減少，其他細(xì)胞增生（Annu. Rev. Anim. Biosci. 2013. 1:43–64）,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),31,the PCV2-associated lymphoid depletion and histiocyticto-granulomatous replacement of the follicle with multinucleated giant

22、cells in the center.,the PCV2-induced lymphoid depletion in the tonsils and PCV2-specific antigen(brown staining),2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),32,單獨(dú)感染的致病機(jī)理,1、感染單核巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，但不復(fù)制。 單核吞噬細(xì)胞——非特異殺傷外來(lái)病原 樹(shù)突狀細(xì)胞：抗原遞呈功能

23、2、細(xì)胞因子的水平：IL-2、IL-4、IL-10、IL-12的mRNA 下降，T細(xì)胞免疫抑制。3、引起淋巴細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致B和T淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少（？）4、III型過(guò)敏反應(yīng)，引起皮炎和腎病：原因：早期感染或高水平抗體,致病機(jī)制-感染PCV2后PAM轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,芯片分析，發(fā)現(xiàn)大量的炎性相關(guān)因子上調(diào)表達(dá)，這可能是PCV2引起全身性炎癥反應(yīng)的內(nèi)在原因。大量抗原遞呈相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，這些基因的上調(diào)會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫。大量細(xì)胞增殖

24、相關(guān)及細(xì)胞凋亡基因差異表達(dá)，說(shuō)明PCV2能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，最大限度的增殖病毒。抑制NFκB信號(hào)通路相關(guān)基因被鑒定，說(shuō)明PCV2感染后能導(dǎo)致機(jī)體的免疫抑制。,炎癥反應(yīng),炎癥是臨床常見(jiàn)的一個(gè)病理過(guò)程，可以生于機(jī)體各部位的組織和各器官，例如扁桃體炎、肺炎、腎炎等。急性炎癥時(shí)具有紅、腫、熱、痛、組織/器官功能衰竭等變化，同隨時(shí)常伴有發(fā)熱、白細(xì)胞增多等全身反應(yīng)，實(shí)質(zhì)上是機(jī)體與致炎因子進(jìn)行抗?fàn)幍慕Y(jié)果。,炎癥反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),,圖解見(jiàn)備注,

25、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,NF-κB是最早由Sen和Baltimore首先從B淋巴細(xì)胞核提取物中檢測(cè)到的一種能與免疫球蛋白鏈基因增強(qiáng)子кB序列特異結(jié)合的核蛋白因子。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子, 在機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。,NF-κB/Rel family,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),37,實(shí)驗(yàn)室混合感染模型,革蘭氏陰性細(xì)菌感染： 副豬嗜血桿菌血清4型和5型、豬鏈球菌與PCV2

26、混合感染研究： LPS為PCV2增殖促進(jìn)因子，與Chang et al., 2006結(jié)果一致。,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),38,感染PCV2的不同結(jié)局,B.R. Trible, R.R.R. Rowland / Virus Research 164 (2012) 68– 77,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),39,4、臨床癥狀,（1）、斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）（2）、皮炎與

27、腎病綜合癥（PDNS）（3）、繁殖障礙：妊娠早期流產(chǎn)（4）、先天型性震顫：[1][2][3]（豬瘟？）,國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目資助,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),40,4-1、斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）,臨床表現(xiàn)：發(fā)熱，消瘦，衰竭病理變化：脾臟壞死、腹股溝或腸系膜淋巴結(jié)腫大；肺間質(zhì)水腫（肺炎）,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),41,A thin undersized pig affected

28、 by PMWS（斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征）,The accentuated spine (明顯突出的脊椎) reflects the growth retardation (生長(zhǎng)停滯) in pigs with PMWS.,Clinical symptoms （Jimmy Kwang, TLL, NUS),相同日齡豬生長(zhǎng)速度不同，豬群整齊度差,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),42,,,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病

29、診斷培訓(xùn),43,流行病學(xué)特征,,來(lái)自臨床第一線的圖片：腫大的腹股溝淋巴結(jié),2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),44,,,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),45,心肌冠狀溝膠凍樣,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),46,圓環(huán)病毒病Vs 大腸桿菌水腫病,2011.3.23西安,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),47,肺間質(zhì)增寬，水腫,弓形體；巴氏桿菌藍(lán)耳??？？,2013-11-23,湖北省動(dòng)

30、物疫病診斷培訓(xùn),48,4-2、皮炎與腎病綜合癥（PDNS）,死亡率低，可以自行康復(fù)，影響種豬外觀。 ；圓環(huán)斑：紫色，與周圍正常皮膚的界限清楚；豬無(wú)癢感； 與缺鋅、疥螨病和壞死性皮炎的區(qū)別皮膚不呈油膩狀（干躁）本質(zhì)上是一種過(guò)敏反應(yīng)（早期感染后，再次感染），免疫復(fù)合物沉積所致,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),49,,,圓環(huán)病毒：皮炎,2013-7-6,拜耳長(zhǎng)沙BET會(huì)議,50,2013.6.18.網(wǎng)絡(luò)咨詢

31、，50-80kg豬，死亡。PCV2引起的皮炎,,2013-7-6,拜耳長(zhǎng)沙BET會(huì)議,51,鑒別診斷：母豬鋅缺乏癥,2013-7-6,拜耳長(zhǎng)沙BET會(huì)議,52,滲出性皮炎,,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),53,4-3 母豬圓環(huán)病毒皮炎與繁殖性能下降,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),54,4-4 PCV2引起先天性震顫和腹瀉,病毒見(jiàn)于神經(jīng)元的胞核和胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核呈強(qiáng)陽(yáng)性，少量的小膠質(zhì)細(xì)胞呈陽(yáng)性。,小腸：黏膜

32、固有層內(nèi)淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞胞漿呈陽(yáng)性,2013-6-19,株洲會(huì)議,55,（5）急性肺臟水腫,肺臟實(shí)變胸腔積液病豬突然死亡,JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2011, p. 2012–2016 Vol. 49, No. 5,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),56,5、診斷方法的應(yīng)用,（1）病原學(xué)檢測(cè)：用于精液中病毒的檢查（2）血清學(xué)檢測(cè)：評(píng)價(jià)免疫整齊度，不用于感染的診斷

33、或調(diào)查。（3）綜合判定：結(jié)合臨床特征，排除影響豬生長(zhǎng)的其它疾?。焊篂a耐過(guò)豬、寄生蟲(chóng)病豬、飼料質(zhì)量不良,國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),57,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,5-1、病原檢測(cè) （1）病毒分離鑒定：PCV2 WH株 （2）PCR：區(qū)分PCV1和PCV2 區(qū)分PCV2病毒兩種基因型（2a,2b,2c?)：不同基因型的毒力差異？ （3）基因組測(cè)序：檢測(cè)病毒的變異

34、（4）熒光定量PCR：測(cè)定PCV2病毒載量 （5）免疫組化：發(fā)現(xiàn)組織中的病毒抗原,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),58,PCV2全基因序列PCR擴(kuò)增,注：1、2、3陽(yáng)性結(jié)果；大小 1767bp或1768bp,引物：P1：5’- GTA CCT TGT TGG AGA GCG GG -3’ P2：5’- TCA CAG CAG TAG ACA GGT CA-3’，,PCR反應(yīng)體系50μL：模板1μL，10×

35、Buffer5μL，dNTP4μL，引物均為0.4μΜ；反應(yīng)條件：95℃2 min，94℃1min， 58℃1 min，72℃2 min。,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),59,以血液為樣品進(jìn)行圓環(huán)病毒2型病原學(xué)檢測(cè),2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),60,PCV2基因分型PCR方法的初步應(yīng)用,注：樣品6、21 為單純PCV2a陽(yáng)性； 樣品1、4、5、6、7、8、9、15、16、17、18、19

36、、20為PCV2b陽(yáng)性結(jié)果；21為陽(yáng)性對(duì)照；22為陰性對(duì)照；M為DL2000,PCV2a-PCR,PCV2b-PCR,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),61,,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)豬2型圓環(huán)病毒,R2：0.997178,PCV2F：5’-CCAGGAGGGCGTTCTGACT-3’； PCV2R：5’-CGTTACCGCTGGAGAAGGAA-3’； Probe PCV2S：5’AATGGCATCTTCAACA

37、CCCGCCTCT-3 本方法用于評(píng)估感染或攻毒豬的病毒血癥高低和病毒培養(yǎng)的含量測(cè)定。,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),62,5-2、抗體檢測(cè),ORF2－ELISA和免疫酶單層過(guò)氧化物酶試驗(yàn)：未免疫豬群感染調(diào)查、免疫豬群免疫狀況評(píng)估中和試驗(yàn)：與保護(hù)力有關(guān)（一般在免疫后3周）；同時(shí)，γ-干擾素水平也與保護(hù)力相關(guān)。,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),63,6. 疫苗研究,6.1、滅活疫苗 （1）免疫原選

38、擇：不同病毒株；桿狀病毒或PCV1表達(dá)PCV2衣殼蛋白（Cap蛋白）。 （2）免疫原的制備：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)；懸浮培養(yǎng) （3）病毒的滅活：甲醛（使蛋白質(zhì)變性）；BEI（破壞核酸） （4）劑型：水包油，油包水，,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),64,疫苗制備毒株的選擇,歐洲的流行毒株基因型也已經(jīng)從PCV2a演變?yōu)镻CV2b.采用我國(guó)流行毒株P(guān)CV2b基因型來(lái)源于PCV2a的疫苗不能提供在PCV2、PPRSV

39、和PPV混合感染情況下，針對(duì)PCV2b毒株及PCV2a/2b的完整保護(hù)力 --Opriessnig et al., 2013, A PCV2 vaccine based on genotype 2b is more effective than a 2a-based vaccine to protect against PCV2b or combined PCV2a/2b viremia in pigs with concur

40、rent PCV2, PRRSV and PPV infection, Vaccine, 31(3),487-94,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),65,病毒的滅活方式,PCV2抵抗力強(qiáng)，傳統(tǒng)方法（甲醛）很難滅活。該試劑只破壞病毒表面蛋白。BEI滅活劑的選擇：可破壞核酸，摧毀病毒復(fù)制能力，但是不破壞病毒的免疫原性蛋白。作為免疫原，保持其空間構(gòu)像是關(guān)鍵因素之一。如大腸桿菌表達(dá)的ORF2蛋白，免疫后能產(chǎn)生抗體，但無(wú)中和

41、活性。,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),66,病毒滅活后細(xì)胞傳代檢驗(yàn)-滅活徹底,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),67,獲得國(guó)家新獸藥注冊(cè)證書(shū),2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),68,豬圓環(huán)病毒病新型疫苗研究,6.2、弱毒疫苗： PCV2 ORF3基因缺失毒株 PK-15連續(xù)傳120代致弱（ORF2中：110位氨基酸: 脯氨酸 to 丙氨酸; 191位氨基酸: 精

42、氨酸 to 絲氨酸）6.3 基因工程疫苗 以偽狂犬病為載體 以減毒沙門氏菌為載體6.4 DNA疫苗,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),69,疫苗實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)指標(biāo),（1）體溫反應(yīng) （2）病毒血癥（定性或定量）（臨床試驗(yàn)中也需要測(cè)定的指標(biāo)） （3）抗體水平（ELISA抗體） （4）免疫后攻毒豬的病理變化 （5）免疫組化觀察病毒在淋巴結(jié)的分布,2013-11-23,湖北

43、省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),70,效力試驗(yàn)中組織病理學(xué)評(píng)價(jià)—肺臟,106 TCID50,輕度肺泡壁充血,107 TCID50,未見(jiàn)明顯的病理變化,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),71,效力試驗(yàn)中組織病理學(xué)評(píng)價(jià)-淋巴結(jié),未免疫攻毒組,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),72,組織學(xué)病理變化——淋巴結(jié),正在變性,網(wǎng)狀細(xì)胞的變性壞死,未免疫攻毒組,105 TCID50 免疫組,淋巴濾泡網(wǎng)狀細(xì)胞變性壞死,2013-11-23,湖

44、北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),73,組織學(xué)病理變化——淋巴結(jié),106 TCID50 免疫組,淋巴竇出血,107 TCID50免疫組,未見(jiàn)明顯的病理變化,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),74,6、疫苗臨床評(píng)價(jià),（1）提高保育豬或全程的成活率（2）提高豬群的整齊度（3）提高飼料報(bào)酬（4）降低其他疾病混合發(fā)生（5）經(jīng)濟(jì)效益提升,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),75,經(jīng)濟(jì)效益分析,保育階段的經(jīng)濟(jì)效益,育肥階段的經(jīng)濟(jì)效

45、益,對(duì)于年出欄1萬(wàn)頭規(guī)模的豬場(chǎng)，出欄豬的平均重95千克，將增加的效益大約為：【21.35+（23-8）×0.33+11.7+（95-23）×0.24】×10000=552,800元,,,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),76,如何正確使用疫苗？,是否應(yīng)該使用疫苗：保育階段成活率低于90％時(shí)；皮炎出現(xiàn)，預(yù)示保育階段感染。疫苗只起預(yù)防作用，不作為治療目的。高水平中和抗體可清除病毒。在3－4周齡使

46、用，可取得預(yù)期的效果干擾素對(duì)本疫苗沒(méi)有影響。其它注意事項(xiàng)：疫苗的保管，注射前平衡到室溫；針頭消毒,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),77,豬圓環(huán)病毒病疫苗不同免疫程序的優(yōu)缺點(diǎn),母豬免疫：節(jié)省費(fèi)用；是否有繁殖障礙；仔豬能否獲得均一的抗體水平，需要測(cè)定。仔豬免疫：費(fèi)用相對(duì)高，工作量大；但仔豬群體免疫整齊。母豬與仔豬都免疫：最佳，但成本高、工作量大。,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),78,7、防治措施,免疫

47、預(yù)防：是目前公認(rèn)的最適預(yù)防措施控制繼發(fā)感染： 主要是副豬嗜血桿菌與鏈球菌的感染 個(gè)人建議：豬圓環(huán)病毒+副豬嗜血桿菌：解決保育豬殘次問(wèn)題加強(qiáng)飼養(yǎng)管理 優(yōu)質(zhì)的飼料（原料）：不使用霉變飼料 添加谷氨酰胺和精氨酸減輕PCV2感染小鼠的繁殖障礙問(wèn)題（Ren W, Yin.Y, 2011, 2012, Amino acid）,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),79,8. 控制豬圓環(huán)病毒病，仍

48、需解決的科學(xué)問(wèn)題,（1）病毒與宿主免疫系統(tǒng)相互作用（2）哪些風(fēng)險(xiǎn)因子是必須條件，兩者如何互作？（3）區(qū)分滅活苗免疫和感染豬的方法（4）敏感細(xì)胞系的構(gòu)建與應(yīng)用 （5）不同基因型之間的重組和新病毒的產(chǎn)生（6）混合感染及其防控,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),80,鳴謝：研究團(tuán)隊(duì)+國(guó)內(nèi)外企業(yè),武漢科前、南京天邦、武漢中博和中牧股份、法國(guó)梅里亞公司等國(guó)內(nèi)外企業(yè)的幫助！,2013-11-23,湖北省動(dòng)物疫病診斷培訓(xùn),81,