豬抗藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病相關(guān)基因的鑒定與功能分析.pdf

1、豬病已成為當(dāng)前制約養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，其中豬藍(lán)耳病和圓環(huán)病毒病為危害世界養(yǎng)豬生產(chǎn)的兩大重要的疫病。 PRRSV和PCV2都是能導(dǎo)致豬繁殖障礙的主要病原，此外，造成豬的免疫抑制，引起其他病原微生物的繼發(fā)或并發(fā)感染，給世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬的遺傳學(xué)組成能夠影響宿主對病毒的易感。研究表明，不同的豬種間對PRRSV和PCV2相關(guān)疾病的易感性存在差異是由于宿主遺傳差異導(dǎo)致的。本研究首先對與PRRSV抗性相關(guān)的兩個(gè)候選基因U

2、SP18和Mx1進(jìn)行了啟動(dòng)子區(qū)功能分析，然后在實(shí)驗(yàn)條件下，研究遺傳背景不同的萊蕪豬和大長雜交商品豬對 PCV2易感是否存在差異以及探討抗性或易感差異的分子機(jī)制，尋找與豬抗 PPRSV和 PCV2有關(guān)的分子標(biāo)記。主要的研究結(jié)果如下：
　　1.本研究對比了中國地方豬種大蒲蓮豬和杜-大-長雜交商品豬 USP18基因啟動(dòng)子區(qū)活性，以及篩選了單核苷酸多態(tài)性對 USP18轉(zhuǎn)錄的影響。我們發(fā)現(xiàn)大蒲蓮豬的啟動(dòng)子活性明顯高于杜-大-長雜交商品豬（P

3、<0.05）；啟動(dòng)子刪除試驗(yàn)中，當(dāng)啟動(dòng)子從-1790刪除到-1314時(shí)，其轉(zhuǎn)錄活性下降約60％（P<0.05）；同時(shí)MARC-145細(xì)胞感染PRRSV前后，在此區(qū)段的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)G-1533A均能提高USP18基因mRNA的表達(dá)。群體遺傳學(xué)分析結(jié)果顯示等位基因A只存在于對PRRSV抗性更強(qiáng)的中國豬種中。這些結(jié)果表明豬USP18基因啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)G-1533A多態(tài)性是抗PRRSV的一個(gè)潛在的DNA分子標(biāo)記。
　　2.

4、豬Mx1基因啟動(dòng)子區(qū)的-2713到-2565和-688到-431兩個(gè)區(qū)域存在順式作用元件。通過對擴(kuò)增的豬Mx1基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行測序和比對，發(fā)現(xiàn)在-547位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)275bp的短散布重復(fù)元件（SINE）。等位基因B（有275bp的插入）主要存在于中國地方豬種中，而在西方瘦肉品種中頻率很低。分別將含有和不含275bp片段插入的啟動(dòng)子通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，比較其熒光素酶活性。結(jié)果顯示不論是在感染豬繁殖與呼吸綜合征（PRRSV）

5、前還是感染后，275bp片段的插入均顯著提高了熒光素酶的活性(P<0.05)。這些結(jié)果表明Mx1基因啟動(dòng)子區(qū)-547位點(diǎn)的SINE插入多態(tài)性是一個(gè)潛在的抗PRRSV的DNA分子標(biāo)記。
　　3．隨機(jī)采樣6周齡的15頭萊蕪豬和15頭大長雜交商品豬。所有的豬只PCV1，PCV2， PRRSV和 PPV抗原抗體檢測為陰性。隨機(jī)分成四組，萊蕪豬和大長雜交商品豬攻毒組各10頭，對照組各5頭。攻毒組肌肉注射3mL(103.8TCID50/mL)

6、的PCV2-SD毒株，對照組接種等量的磷酸鹽緩沖液。攻毒當(dāng)天被記為0d。攻毒后每天測量體溫，觀察臨床癥狀，分別在0d、4d、7d、10d、14d、21d、28d、35d稱重、采集血液，利用PCR及絕對定量PCR對血清中的PCV2 DNA病毒拷貝數(shù)及細(xì)胞因子的變化（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、GM-CSF、IFN-γ、TGF-β1和 TNFα）進(jìn)行分析，ELISA試劑盒檢測IgG的變化。35

7、d剖殺時(shí)采集肺臟、扁桃體、胸腺、回腸、脾臟、肝臟和淋巴結(jié)等組織，10%福爾馬林溶液固定，制作組織切片，HE染色觀察病理變化。
　　結(jié)果表明：從攻毒的0d到35d，攻毒組萊蕪豬與攻毒組商品豬相比，60%(6/10)的商品豬出現(xiàn)了豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的典型臨床癥狀，例如食欲下降，咳嗽，拉稀和漸進(jìn)性消瘦，偶爾打噴嚏；攻毒14d后，商品豬最顯著的癥狀是皮膚上出現(xiàn)圓形或形狀不規(guī)則的紅紫斑和丘疹，主要是在背部和后退部位。大約一半的商品豬攻

8、毒后14d到28d間出現(xiàn)了呼吸急促。萊蕪豬未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，只出現(xiàn)輕微的厭食，咳嗽和發(fā)熱等癥狀。與對照組相比，商品豬從攻毒后的第10d開始直腸溫度高于40℃一直持續(xù)到14d。萊蕪豬體溫變化不顯著。與對照組比，在整個(gè)攻毒期間萊蕪豬的體重?zé)o顯著變化，而商品豬在攻毒后21d到35d之間平均體重明顯低于對照組。大長雜交商品豬的肺臟出現(xiàn)不同程度的肺充血，嚴(yán)重病例肺泡出血，肺小葉間質(zhì)明顯增寬，出血嚴(yán)重，支氣管處出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤。肝臟為輕度到

9、中度的肝萎縮，花斑肝，被膜下淋巴細(xì)胞大量減少，而萊蕪豬攻毒后未出現(xiàn)此類臨床癥狀。萊蕪豬與大長豬的IgG總含量在感染PCV2期間沒有出現(xiàn)顯著差異，但是萊蕪豬IgG的總含量高于大長豬的總含量。在感染PCV2的早期，萊蕪豬血清中IL-6（P<0.01）、IL-4、IL-8和TGF-β1水平均顯著上升（P<0.05），大長雜交豬血清中的炎性細(xì)胞因子TNF-α的蛋白水平顯著上升（P<0.05），趨化因子IL-8的表達(dá)量持續(xù)下降，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-

10、10表達(dá)水平后期突然顯著升高（P<0.05），綜合分析上述細(xì)胞因子的表達(dá)動(dòng)態(tài)表明，PCV2感染后大長雜交豬出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致豬早期抗病毒能力和趨化功能降低，使大長雜交豬的免疫調(diào)節(jié)機(jī)能出現(xiàn)抑制和紊亂。大長雜交商品豬血清中的PCV2 DNA病毒的拷貝數(shù)均高于萊蕪豬，且在攻毒后第35d達(dá)到了顯著性差異（P<0.05）。
　　4．利用RNA-seq技術(shù)分析了萊蕪豬和大長雜交商品豬感染PCV2后肺臟組織的差異基因表達(dá)的情況，兩個(gè)品種共找

11、出了374個(gè)差異表達(dá)基因，萊蕪豬攻毒組與對照組相比，有83個(gè)上調(diào)基因和86個(gè)下調(diào)基因；商品豬中187個(gè)上調(diào)基因，18個(gè)下調(diào)基因。在這些差異表達(dá)基因中，兩個(gè)豬種中5個(gè)共同上調(diào)基因和4個(gè)下調(diào)基因。對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋發(fā)現(xiàn)大長雜交商品豬中有150、160和156個(gè)基因被注釋到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能的條目中；萊蕪豬有149、134和134個(gè)基因被分別注釋相應(yīng)的三個(gè)條目中。374個(gè)差異表達(dá)基因被注釋到了KEGG數(shù)據(jù)庫中的299條

12、通路中，每條通路中的差異表達(dá)基因從1到25個(gè)不等。其中具有代表性的通路是補(bǔ)體和凝血級聯(lián)通路、RIG-I-like受體信號通路和B細(xì)胞受體通路。定量PCR結(jié)果顯示，補(bǔ)體凝血級聯(lián)通路中的肺組織的損傷有關(guān)的4個(gè)基因（TFPI、SERPINC1、SERPINA1和SERPINA5)均在攻毒的萊蕪豬中顯著表達(dá)上調(diào)，而在大長雜交商品豬中的無明顯表達(dá)變化。通過對表達(dá)譜數(shù)據(jù)的分析，初步篩選出導(dǎo)致PCV2感染產(chǎn)生不同的肺部病變的差異表達(dá)基因。
　　

13、綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首先對與PRRSV抗性相關(guān)的兩個(gè)基因USP18和Mx1進(jìn)行了啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)分析，結(jié)果表明豬USP18基因啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)G-1533A多態(tài)性和Mx1基因啟動(dòng)子區(qū)-547位點(diǎn)的SINE插入多態(tài)性均可以作為潛在的抗PRRSV的DNA分子標(biāo)記。然后對地方豬種和雜交商品豬感染 PCV2抗性或易感性是否存在差異以及存在此差異的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示，萊蕪豬和大長雜交商品豬對 PCV2感染的生物學(xué)反應(yīng)有所不同，二者在感