通城豬抗藍耳病的microRNAs篩選及其調(diào)控網(wǎng)絡分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）俗稱藍耳病，以流行地域廣、傳播速度快、感染率高等特點成為全球規(guī)模化豬場的主要疫病之一，主要造成妊娠母豬的繁殖障礙及引起各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病。PRRS是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus，PRRSV）引起的，PRRS

2、V是一種單股正鏈RNA病毒，具有易變性且能引起宿主的免疫抑制，給獸醫(yī)臨床進行該病的控制帶來很大困難，目前尚無有效的防控辦法。通城豬是我國優(yōu)良的地方品種，具有抗逆性強，肉質(zhì)鮮嫩等特點，在HP-PRRS爆發(fā)期間，地處湖北省通城縣境內(nèi)的通城豬卻無一例是因感染HP-PRRS而死亡的報道，故推測通城豬對HP-PRRS具有一定的抗性。MicroRNA(miRNA)作為一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為20-24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在原核生物到

3、哺乳動物中廣泛分布并普遍參與機體內(nèi)多種生命過程的調(diào)控，已有報道m(xù)iR-181、miR-125b等能抑制PRRSV在宿主中的增殖，在PRRSV感染機體后是否有大量的miRNAs參與抗病毒作用尚且不知。本研究以通城豬和大白豬為材料，利用人工感染PRRSV后和感染前的肺泡巨噬細胞(Porcine Alveolar Macrophages，PAMs)進行小RNA高通量測序，篩選在兩品種感染前后和品種間PAMs中差異表達的miRNAs并分析其調(diào)控

4、網(wǎng)絡，為進一步篩選通城豬中的抗PRRSV的miRNAs奠定基礎。本研究的主要內(nèi)容及結果如下:
　　(1)人工感染PRRSV后，通城豬的肺部病變和炎癥比大白豬輕，肺組織中的病毒載量低于大白豬。
　　利用5周齡且PRRSV、PCV、PRV三種病毒都為陰性的健康斷奶仔豬通城豬22頭和大白豬12頭，按照同胞關系均勻隨機分為感染組和對照組，經(jīng)過預試驗后進行人工感染，試驗組豬肌肉注射PRRSV-WuH3毒株，對照組豬肌肉注射DMEM;感

5、染后第7天剖檢，取肺臟等組織器官，每個肺臟的一側采用PBS經(jīng)支氣管肺泡灌洗技術來收集PAMs，提取總RNA后用于小RNA的高通量測序，另一側采集肺組織樣品后用4％的多聚甲醛固定，用來制作病理切片并進行免疫組化分析。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，6頭感染組豬在2-5天內(nèi)先后出現(xiàn)精神沉郁，采食下降、嘔吐、喘氣、高溫、發(fā)熱等癥狀，感染組的大白豬比通城豬體溫升高更多，病癥更明顯;解剖時觀察肺部大體病變，發(fā)現(xiàn)感染組的大白豬肺臟明顯水腫，表面有大量出血點，肺葉出現(xiàn)

6、深紅色實變區(qū)，淋巴結廣泛腫大，通城豬肺部腫脹，實變程度比大白豬輕，粉色有彈性，呈海綿狀。用采集的肺組織樣制作石蠟切片，經(jīng)HE染色后于倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)通城豬和大白豬感染PRRSV后，肺臟均出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎的病變，細支氣管和血管周圍有單核巨噬細胞浸潤，大部分肺泡壁顯著增厚，肺泡腔狹窄，腔內(nèi)主要可見壞死細胞，有均質(zhì)紅染的漿液及巨噬細胞，從組織學病變的嚴重程度比較，大白豬較通城豬更嚴重。對照組的通城豬和大白豬肺臟組織結構清楚，未見異常變化。

7、用辣根過氧化物酶標記的PRRSV山羊抗鼠IgG抗體通過免疫組化法來觀察PRRSV抗原在肺臟中的分布，在顯微鏡完全相同的圖像采集條件下，每張切片在40倍鏡下隨機選取至少5個視野，用軟件IPP6.0進行定量分析，觀察發(fā)現(xiàn)PRRSV抗體陽性反應產(chǎn)物在感染組豬肺臟中主要分布于肺泡巨噬細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞、淋巴細胞及脫落細胞，在同一品種內(nèi)，相對于對照組而言，感染組的豬肺臟中PRRSV陽性信號明顯分布，而在感染組內(nèi)，通城豬肺臟中PRRSV的分布量

8、少于大白豬。
　　(2)通城豬和大白豬感染PRRSV前后的12個PAM樣本進行小RNA組的高通量測序，每個樣本得到至少0.5G的數(shù)據(jù)，獲得至少10327597條原始序列，比對得到391個已知豬的成熟miRNA，其中67個在不同組合中差異表達。
　　選擇12頭豬的PAM作為測序樣本，提取總RNA后構建12個cDNA文庫，于Illumina HiSeq2000平臺進行小RNA組的高通量測序，每個樣本得到的原始數(shù)據(jù)量都在0.5G以

9、上，至少獲得10327597條原始序列，過濾后得到的純凈序列reads數(shù)均占原始序列總reads數(shù)的95％以上，20bp左右的堿基錯誤率都在0.02％以內(nèi)。利用miRDeep2將測序序列與GeneBank中豬基因組序列及miRBase中成熟miRNA序列進行比對，發(fā)現(xiàn)在12個樣本中均得到391個已報道的豬的成熟miRNA。兩兩組合T檢驗篩選出了67個差異表達miRNAs，篩選標準為T-test的P值≤0.05，foldchange＞1為

10、上調(diào)，fold change＜1為下調(diào)，其中通城豬感染組與對照組(TC-INJ-CON)相比顯著下調(diào)表達的miRNA有4個(miR-101、miR-146b、miR-296-3p和miR-664-5p)，而上調(diào)表達的miRNA有5個(miR-22-3p、miR-24-2-5p、miR-27b-5p、miR-423-5p和miR-7137-5p);而大白豬感染組與對照組(LW-INJ-CON)相比顯著下調(diào)表達的miRNA有36個，上調(diào)表達

11、的miRNA有20個;通城豬感染組與大白豬感染組(TC-INF-LW)相比，有5個下調(diào)的miRNA和3個上調(diào)的miRNA;通城豬對照組和大白豬對照組(TC-CON-LW)比較，有4個下調(diào)miRNA和3個上調(diào)miRNA。其中，12個miRNAs出現(xiàn)在多個組合中，例如miR-101在TC-INF-CON中下調(diào)，而在LW-INF-CON和TC-CON-LW中上調(diào)，miR-296-3p和miR146b在TC-INF-CON和LW-INF-CON

12、兩個組合中均下調(diào)，而miR-423-5p和miR7137-5p在TC-INF-CON和LW-INF-CON兩個組合都是上調(diào)。
　　(3)預測到67個差異表達miRNAs的宿主靶基因有22234個，在PRRSV基因組上的結合靶點有119個，宿主靶基因富集到多條GO Terms和KEGG通路中，并形成miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡。
　　利用軟件TargetScanHuman6.2預測差異表達miRNAs在豬基因組中的靶基因，得到

13、22243個mRNA-miRNA互作位點，利用軟件miRanda預測到差異表達miRNA在PRRSV基因組上有119個結合靶點。通城豬感染組與對照組差異表達miRNAs的靶基有4474個，富集到801條GO Terms和50個KEGG通路中，大白豬感染組與對照組差異表達miRNAs的靶基有12856個，富集到901條GO Terms和57個KEGG通路中。在二者共有的42個通路中，有12個與信號轉(zhuǎn)導相關的通路和18個與疾病癌癥相關的通路

14、，還有巨噬細胞內(nèi)受體FcγR介導的吞噬作用通路，推測此通路可能與宿主抗病毒的先天性免疫或PRRSV侵入機制有關。結合本課題組轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的分析結果（另文見博士生梁婉的論文），將通城豬的差異表達miRNA和mRNA聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)有8個差異表達miRNAs能靶向143個差異表達基因，其中4個下調(diào)的miRNA對應37個上調(diào)的基因，4個上調(diào)的miRNA對應38個下調(diào)的基因，將143個差異基因用在線軟件DAVID作GO和KEGG分析，富集到51