豬抗豬鏈球菌病抗病相關(guān)基因的篩選.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis,S.suis）是一種重要的人獸共患病病原，不僅嚴(yán)重制約著各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，還威脅著人類(lèi)的健康。在其現(xiàn)有的33種血清型（1-31型，33型和1/2型）中，以豬鏈球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）毒力最強(qiáng)，流行最廣。目前，豬鏈球菌?。⊿wine Streptococcosis）的防治措施主要包括加強(qiáng)管理、接種疫苗和藥物防治，然而這些措施的效果有限。隨著動(dòng)物轉(zhuǎn)基

2、因技術(shù)的發(fā)展，抗病育種方法可為豬鏈球菌病的防治提供新的思路。
　　1.不同品系小鼠對(duì)豬鏈球菌2型易感性試驗(yàn)
　　小鼠感染SS2后的臨床特征與豬感染相似，且不同品系小鼠對(duì)SS2的易感性存在差異，可作為動(dòng)物模型研究豬的感染過(guò)程。本試驗(yàn)將B6，A/J和BALB/c三個(gè)品系小鼠分別隨機(jī)分為四組，其中三組作為試驗(yàn)組，每組8-10周齡雌性和雄性小鼠各10只，共20只;剩余一組為對(duì)照組，8-10周齡雌性和雄性小鼠各3只，共6只。三組試驗(yàn)組

3、小鼠分別通過(guò)腹腔接種1mL劑量為5×107 CFU/mL、1×108 CFU/mL和5×108CFU/mL的ZY05719菌液;對(duì)照組小鼠腹腔接種等量無(wú)菌THB培養(yǎng)液，觀察并記錄各組小鼠死亡情況;對(duì)3天內(nèi)死亡的小鼠立即剖取腦組織進(jìn)行菌落臟器分布計(jì)數(shù)，對(duì)15天后依然存活的小鼠統(tǒng)一采血測(cè)定抗體效價(jià)，同時(shí)，選取典型癥狀小鼠制作病理切片，從而確定對(duì)ZY05719菌株易感和抗病的小鼠品系以及合適的攻毒劑量。結(jié)果表明，在不同攻毒劑量下，B6和BAL

4、B/c小鼠對(duì)SS2的易感性存在差異，但均不顯著，兩品系小鼠對(duì)SS2均表現(xiàn)出較好的抗病性;當(dāng)攻毒劑量為1×108CFU/mL時(shí)，B6和A/J小鼠對(duì)SS2的易感性具有顯著差異，其中A/J小鼠表現(xiàn)為易感，B6小鼠表現(xiàn)為抗病。本試驗(yàn)成功確定了SS2的易感和抗病小鼠品系，為篩選豬抗豬鏈球菌病抗病相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。
　　2.B6與A/J小鼠雜交F2代對(duì)豬鏈球菌2型易感性的GWAS分析
　　全基因組關(guān)聯(lián)分析是利用統(tǒng)計(jì)學(xué)工具檢測(cè)全基因組范

5、圍內(nèi)遺傳標(biāo)記與可觀性狀間遺傳關(guān)聯(lián)的一種有效方法。本試驗(yàn)選擇A/J和B6小鼠為親本，以非近交形式連續(xù)雜交兩代構(gòu)建F2代小鼠動(dòng)物模型。對(duì)F2代小鼠每只腹腔注射1×108 CFU ZY05719菌液，根據(jù)死亡情況及其他輔助指標(biāo)篩選抗病樣本和易感樣本共90個(gè)。提取樣本基因組DNA，質(zhì)檢合格后處理基因組DNA，設(shè)計(jì)比對(duì)方案，通過(guò)Affymetrix(@)MouseDiversity Genotyping Array掃描分析獲得顯著SNP位點(diǎn)。從M

6、anhattan圖中可以看出，2號(hào)染色體的qB、qC1.1區(qū)段上有明顯聚集的顯著關(guān)聯(lián)信號(hào);與其他染色體相比，7號(hào)染色體qA1、qE3區(qū)段和12號(hào)染色體qF2區(qū)段的SNP位點(diǎn)也較為顯著，可能與小鼠對(duì)SS2的易感性有關(guān)，應(yīng)給予重點(diǎn)關(guān)注。
　　3.豬鏈球菌2型感染不同品系小鼠基因表達(dá)譜差異分析
　　基因芯片可高通量檢測(cè)基因的功能及表達(dá)情況，還可單獨(dú)分析基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中單基因和多基因的調(diào)控作用。本試驗(yàn)選用8-10周齡A/J和B6雄性小

7、鼠為動(dòng)物模型，每個(gè)品系小鼠隨機(jī)分為四組，每組3只小鼠。其中三組小鼠每只小鼠腹腔注射1×108 CFU ZY05719菌液，分別于攻毒2、4、8h時(shí)采血;剩余組小鼠作為空白對(duì)照注射等量THB培養(yǎng)液后采血。血液樣本提取RNA，質(zhì)檢合格后處理RNA樣本，設(shè)計(jì)比對(duì)方案，通過(guò)GeneChip(@)Mouse Transcriptome Assay1.0掃描分析獲得差異表達(dá)基因。對(duì)獲得的基因進(jìn)行通路分析和基因本體分析，結(jié)果表明，差異表達(dá)基因所參與的

8、通路和功能包括B細(xì)胞和T細(xì)胞受體信號(hào)途徑、抗原的處理與遞呈、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、金黃色葡萄球菌感染等，與免疫關(guān)系密切，可能與抗豬鏈球菌病抗病性相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。
　　4.豬抗豬鏈球菌病抗病相關(guān)基因的分析
　　為深入挖掘豬抗豬鏈球菌病抗病相關(guān)基因，綜合SNP芯片結(jié)果與基因表達(dá)譜芯片結(jié)果進(jìn)行分析。以顯著SNP位點(diǎn)上下游500kb區(qū)段為拓展區(qū)間，篩選該范圍內(nèi)差異表達(dá)的基因，獲得候選基因集。根據(jù)曼哈頓放大圖和相關(guān)資料進(jìn)一步挑選可能與抗

9、豬鏈球菌病抗病相關(guān)的基因，利用CRISPR/Cas9基因定點(diǎn)編輯技術(shù)對(duì)這些基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。ArhGAP15參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架形態(tài)、抑制Rac1蛋白活性等活動(dòng)，同時(shí)與細(xì)菌感染密切相關(guān);Epn1作為細(xì)胞內(nèi)吞作用的接頭，參與網(wǎng)格蛋白依賴(lài)的內(nèi)吞作用;CD55可通過(guò)經(jīng)典補(bǔ)體途徑和替代補(bǔ)體途徑抑制攻膜復(fù)合體的形成，從而保護(hù)細(xì)胞免受攻擊。選擇這三種基因作為目的基因，采用CRISPR/Cas9技術(shù)在細(xì)胞水平上對(duì)其進(jìn)行敲除，目前已初步獲得敲除ArhGAP