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文檔簡(jiǎn)介
1、豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一種重要的人獸共患病病原,不僅嚴(yán)重制約著各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,還威脅著人類(lèi)的健康。在其現(xiàn)有的33種血清型(1-31型,33型和1/2型)中,以豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)毒力最強(qiáng),流行最廣。目前,豬鏈球菌?。⊿wine Streptococcosis)的防治措施主要包括加強(qiáng)管理、接種疫苗和藥物防治,然而這些措施的效果有限。隨著動(dòng)物轉(zhuǎn)基
2、因技術(shù)的發(fā)展,抗病育種方法可為豬鏈球菌病的防治提供新的思路。
1.不同品系小鼠對(duì)豬鏈球菌2型易感性試驗(yàn)
小鼠感染SS2后的臨床特征與豬感染相似,且不同品系小鼠對(duì)SS2的易感性存在差異,可作為動(dòng)物模型研究豬的感染過(guò)程。本試驗(yàn)將B6,A/J和BALB/c三個(gè)品系小鼠分別隨機(jī)分為四組,其中三組作為試驗(yàn)組,每組8-10周齡雌性和雄性小鼠各10只,共20只;剩余一組為對(duì)照組,8-10周齡雌性和雄性小鼠各3只,共6只。三組試驗(yàn)組
3、小鼠分別通過(guò)腹腔接種1mL劑量為5×107 CFU/mL、1×108 CFU/mL和5×108CFU/mL的ZY05719菌液;對(duì)照組小鼠腹腔接種等量無(wú)菌THB培養(yǎng)液,觀察并記錄各組小鼠死亡情況;對(duì)3天內(nèi)死亡的小鼠立即剖取腦組織進(jìn)行菌落臟器分布計(jì)數(shù),對(duì)15天后依然存活的小鼠統(tǒng)一采血測(cè)定抗體效價(jià),同時(shí),選取典型癥狀小鼠制作病理切片,從而確定對(duì)ZY05719菌株易感和抗病的小鼠品系以及合適的攻毒劑量。結(jié)果表明,在不同攻毒劑量下,B6和BAL
4、B/c小鼠對(duì)SS2的易感性存在差異,但均不顯著,兩品系小鼠對(duì)SS2均表現(xiàn)出較好的抗病性;當(dāng)攻毒劑量為1×108CFU/mL時(shí),B6和A/J小鼠對(duì)SS2的易感性具有顯著差異,其中A/J小鼠表現(xiàn)為易感,B6小鼠表現(xiàn)為抗病。本試驗(yàn)成功確定了SS2的易感和抗病小鼠品系,為篩選豬抗豬鏈球菌病抗病相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。
2.B6與A/J小鼠雜交F2代對(duì)豬鏈球菌2型易感性的GWAS分析
全基因組關(guān)聯(lián)分析是利用統(tǒng)計(jì)學(xué)工具檢測(cè)全基因組范
5、圍內(nèi)遺傳標(biāo)記與可觀性狀間遺傳關(guān)聯(lián)的一種有效方法。本試驗(yàn)選擇A/J和B6小鼠為親本,以非近交形式連續(xù)雜交兩代構(gòu)建F2代小鼠動(dòng)物模型。對(duì)F2代小鼠每只腹腔注射1×108 CFU ZY05719菌液,根據(jù)死亡情況及其他輔助指標(biāo)篩選抗病樣本和易感樣本共90個(gè)。提取樣本基因組DNA,質(zhì)檢合格后處理基因組DNA,設(shè)計(jì)比對(duì)方案,通過(guò)Affymetrix(@)MouseDiversity Genotyping Array掃描分析獲得顯著SNP位點(diǎn)。從M
6、anhattan圖中可以看出,2號(hào)染色體的qB、qC1.1區(qū)段上有明顯聚集的顯著關(guān)聯(lián)信號(hào);與其他染色體相比,7號(hào)染色體qA1、qE3區(qū)段和12號(hào)染色體qF2區(qū)段的SNP位點(diǎn)也較為顯著,可能與小鼠對(duì)SS2的易感性有關(guān),應(yīng)給予重點(diǎn)關(guān)注。
3.豬鏈球菌2型感染不同品系小鼠基因表達(dá)譜差異分析
基因芯片可高通量檢測(cè)基因的功能及表達(dá)情況,還可單獨(dú)分析基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中單基因和多基因的調(diào)控作用。本試驗(yàn)選用8-10周齡A/J和B6雄性小
7、鼠為動(dòng)物模型,每個(gè)品系小鼠隨機(jī)分為四組,每組3只小鼠。其中三組小鼠每只小鼠腹腔注射1×108 CFU ZY05719菌液,分別于攻毒2、4、8h時(shí)采血;剩余組小鼠作為空白對(duì)照注射等量THB培養(yǎng)液后采血。血液樣本提取RNA,質(zhì)檢合格后處理RNA樣本,設(shè)計(jì)比對(duì)方案,通過(guò)GeneChip(@)Mouse Transcriptome Assay1.0掃描分析獲得差異表達(dá)基因。對(duì)獲得的基因進(jìn)行通路分析和基因本體分析,結(jié)果表明,差異表達(dá)基因所參與的
8、通路和功能包括B細(xì)胞和T細(xì)胞受體信號(hào)途徑、抗原的處理與遞呈、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、金黃色葡萄球菌感染等,與免疫關(guān)系密切,可能與抗豬鏈球菌病抗病性相關(guān),有待進(jìn)一步研究。
4.豬抗豬鏈球菌病抗病相關(guān)基因的分析
為深入挖掘豬抗豬鏈球菌病抗病相關(guān)基因,綜合SNP芯片結(jié)果與基因表達(dá)譜芯片結(jié)果進(jìn)行分析。以顯著SNP位點(diǎn)上下游500kb區(qū)段為拓展區(qū)間,篩選該范圍內(nèi)差異表達(dá)的基因,獲得候選基因集。根據(jù)曼哈頓放大圖和相關(guān)資料進(jìn)一步挑選可能與抗
9、豬鏈球菌病抗病相關(guān)的基因,利用CRISPR/Cas9基因定點(diǎn)編輯技術(shù)對(duì)這些基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。ArhGAP15參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架形態(tài)、抑制Rac1蛋白活性等活動(dòng),同時(shí)與細(xì)菌感染密切相關(guān);Epn1作為細(xì)胞內(nèi)吞作用的接頭,參與網(wǎng)格蛋白依賴(lài)的內(nèi)吞作用;CD55可通過(guò)經(jīng)典補(bǔ)體途徑和替代補(bǔ)體途徑抑制攻膜復(fù)合體的形成,從而保護(hù)細(xì)胞免受攻擊。選擇這三種基因作為目的基因,采用CRISPR/Cas9技術(shù)在細(xì)胞水平上對(duì)其進(jìn)行敲除,目前已初步獲得敲除ArhGAP
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