豬腸道抗TGEV益生菌株篩選及其體外病毒作用.pdf

1、本研究從健康仔豬腸道內(nèi)容物內(nèi)分離篩選具有抗豬傳染性胃腸炎病毒(TransmissibleGastroenteritis Coronavirus，TGEV)活性的益生菌，并進行種屬的鑒定。然后在體外細胞感染模型上，采用MTT比色法，TCID50法，間接免疫熒光法以及半定量RT-PCR法對初篩豬腸道益生菌株進行抗TGEV作用評價。旨在確定益生菌豬腸道分離株是否存在抗TGEV作用，評價其抗病毒水平，為今后開發(fā)抗腹瀉病毒的微生態(tài)制劑奠定理論基礎(chǔ)

2、。
　　 在篩選菌株過程中，首先利用MRS培養(yǎng)基從健康仔豬腸道內(nèi)容物內(nèi)分離出54株益生菌。初步確定為乳酸菌并依次命名為R1-R54，作為試驗菌株開展研究工作。在體外試管平臺上，將TGEV與乳酸菌感作后取上清感染豬睪丸(ST)細胞，運用MTT比色法測定細胞活性初篩出12株對TGEV感染ST細胞具有較強抑制作用的菌株。進一步經(jīng)過耐酸耐膽鹽篩選淘汰4株。對剩余8株具有抗TGEV活性的乳酸菌菌株進行生化鑒定及16SrRNA鑒定。結(jié)果顯示

3、R3、R10、R15、R22、R38和R45為羅伊氏乳桿菌，R30為發(fā)酵乳桿菌，R51為腸膜明串珠菌。
　　 在評價初篩菌株的抗病毒作用時，利用MTT法測定益生菌處理后的細胞活性，經(jīng)統(tǒng)計分析得出益生菌對細胞的最大無毒濃度；利用藥敏試驗篩選出對這8株益生菌均高度敏感的抗生素。然后，根據(jù)上述實驗結(jié)果進行細胞平臺上的益生菌抗病毒作用的研究和評價。
　　 以所選益生菌菌株及其代謝產(chǎn)物的最大無毒劑量為起點，將其梯度稀釋成不同濃度，

4、然后按三種不同方式(即先加益生菌/代謝產(chǎn)物后加病毒、病毒和益生菌/代謝產(chǎn)物同時加入、先加病毒后加益生菌/代謝產(chǎn)物)作用于ST細胞，通過MTT法檢測細胞活性間接反映益生菌對TGEV的抑制作用。結(jié)果顯示益生菌與細胞相互作用后再感染病毒，細胞活力升高，病毒感染能力下降；益生菌與病毒共同接入細胞，發(fā)現(xiàn)病毒對細胞侵害的能力降低，結(jié)果表明益生菌可能對病毒具有直接破壞作用；細胞感染病毒后再接入益生菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益生菌在病毒感染細胞后抵抗TGEV感染的能

5、力相對較弱。
　　 將TGEV分別與初篩益生菌在試管中作用，檢測TGEV半數(shù)組織感染量(TCID50)。結(jié)果經(jīng)8株益生菌處理后，在ST細胞模型上測得TGEV的TCID50/0.1mL分別為10-4.78，10-5.03，10-4.59，10-5.33，10-5.47，10-5.82，10-5.44，10-6.21。與未作處理組病毒TCID50/0.1mL(10-6.46)比較，均有不同程度的降低，表明益生菌對病毒毒力具有顯著的抑

6、制作用。
　　 用初篩益生菌菌體及其代謝產(chǎn)物與細胞作用，再感染病毒，同時設(shè)正常細胞和病毒對照組。培養(yǎng)2小時后利用間接免疫熒光法檢測病毒感染細胞量。結(jié)果顯示益生菌及其代謝產(chǎn)物處理組熒光數(shù)量均有不同程度的減少，表明益生菌及其代謝產(chǎn)物在TGEV吸附細胞的過程中可能具有阻斷作用。
　　 用初篩益生菌菌體及其代謝產(chǎn)物與TGEV在試管中作用90min，再用病毒處理細胞，同時設(shè)正常細胞和病毒對照組。培養(yǎng)24小時后應(yīng)用半定量RT-PCR