對(duì)蝦抗白斑綜合征病毒益生菌的篩選及其作用效果.pdf

1、從上世紀(jì)六十年代以來(lái),對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)在世界范圍內(nèi)得到了快速的發(fā)展,中國(guó)的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)在經(jīng)歷了1993年的銳減之后,經(jīng)過(guò)政府、研究人員和養(yǎng)殖者等多方的努力,又重新登上世界對(duì)蝦養(yǎng)殖第一大國(guó)的位置。但是在這個(gè)輝煌業(yè)績(jī)的背后,也出現(xiàn)了諸多問(wèn)題,如對(duì)蝦質(zhì)量嚴(yán)重退化、免疫力低、抗病力差、蝦病頻發(fā)。雖然可以通過(guò)諸如改良種質(zhì)、優(yōu)化養(yǎng)殖技術(shù)等方式提高對(duì)蝦的成活率,但是增強(qiáng)對(duì)蝦的免疫機(jī)能是最為有效的解決途徑之一。益生菌能提高動(dòng)物的免疫機(jī)能,促進(jìn)動(dòng)物的健康,增強(qiáng)動(dòng)

2、物的抗病力。本實(shí)驗(yàn)分以下四個(gè)部分進(jìn)行:
　　 美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium sp.)和堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus sp.)對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫活性和抗病力的影響的比較研究:在基礎(chǔ)飼料中分別添加分離自健康對(duì)蝦腸道的美人魚發(fā)光桿菌和堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(菌含量不少于1011 CFU/g)的活菌和破碎菌各1g/kg,制備成菌含量不少于108 CFU/g的四組免疫飼料,做為免疫實(shí)驗(yàn)組。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中,飼料中添加堅(jiān)強(qiáng)芽

3、孢桿菌活菌的免疫組凡納濱對(duì)蝦酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)活性顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(P＜0.05);5d、10d時(shí)飼料中添加堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌活菌的免疫組凡納濱對(duì)蝦血清中過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),其他組差異不顯著;飼料中添加益生菌活菌和破碎菌的所有免疫組其究凡納濱對(duì)蝦超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);飼料中添加堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌活菌的免疫組凡納濱對(duì)蝦溶菌酶顯著高于對(duì)照組(P

4、＜0.05)。
　　 本實(shí)驗(yàn)中添加美人魚發(fā)光桿菌滅活菌的免疫組的抗WSSV存活率(0.49±0.15)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。添加堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌活菌免疫組抗WSSV存活率(0.53±0.12)顯著高于對(duì)照組的存活率。
　　 2株消化道共生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗WSSV感染能力的影響及最佳作用時(shí)間的研究:以基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組,在基礎(chǔ)飼料中分別添加分離自健康對(duì)蝦腸道分離的人蒼白桿菌(O.anthropi)和粘著劍菌(Ensif

5、er sp.)(菌含量≥1011 CFU/g)的活菌和破碎菌各1g/kg,制備成菌含量不少于108 CFU/g的免疫飼料,做為免疫實(shí)驗(yàn)組。在免疫10d、25d和35d后的對(duì)蝦進(jìn)行WSSV攻毒,益生菌對(duì)不同作用時(shí)間的對(duì)蝦抗病力的影響,進(jìn)而為益生菌的最佳作用時(shí)間提供理論依據(jù);對(duì)免疫10d、25d的對(duì)蝦,通過(guò)Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)益生菌影響WSSV在對(duì)蝦宿主體內(nèi)定殖進(jìn)行初步探索。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中,各實(shí)驗(yàn)組在感染后的前0-4

6、天存活率差異不顯著(P＞0.05);飼料中添加粘著劍菌免疫35d后,其感染W(wǎng)SSV的免疫保護(hù)率最高為41％±2.5％,顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明飼料中添加粘著劍菌持續(xù)35d后,能在一定程度上提高對(duì)蝦的抗病力。
　　 利用TaqMan MGB探針?lè)謩e檢測(cè)了免疫10d和25d,感染W(wǎng)SSV的對(duì)蝦體內(nèi)WSSV變化情況,對(duì)照組在感染W(wǎng)SSV后,其體內(nèi)WSSV的拷貝數(shù)變化呈遞增趨勢(shì),由103遞增到1011。其余免疫實(shí)驗(yàn)組

7、WSSv拷貝數(shù)均在102-107范圍內(nèi)波動(dòng)。
　　 美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium sp.)和堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus sp.)的培養(yǎng)條件優(yōu)化:本實(shí)驗(yàn)從不同碳源、碳源氮源的不同配比、無(wú)機(jī)鹽成分的不同配比及培養(yǎng)基初始pH等方面進(jìn)行了培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究,為美人魚發(fā)光桿菌和堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明:美人魚發(fā)光桿菌的最佳生長(zhǎng)條件是:培養(yǎng)基初始pH值為7.6;

8、最佳碳源為葡萄糖;不同碳源氮源的優(yōu)化:通過(guò)正交試驗(yàn),初步確定美人魚發(fā)光桿菌的最優(yōu)化碳源氮源成分為:葡萄糖0.5％(W/V),蛋白胨1.0％(W/V),牛肉膏0.2％(W/V),酵母膏0.5％(W/V);不同無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化:通過(guò)正交試驗(yàn),初步確定堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的最優(yōu)無(wú)機(jī)鹽成分為:檸檬酸三鈉1.0‰(W/V),K2HPO4 0.6‰(W/V),KH2PO4 0.1‰(W/V),MgSO4 0.8‰(W/V)。
　　 堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的最佳生

9、長(zhǎng)條件是:培養(yǎng)基初始pH值為6.0;最佳碳源為蔗糖;不同碳源氮源的優(yōu)化:通過(guò)正交試驗(yàn),初步確定堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的最優(yōu)化碳源氮源培養(yǎng)基為:蔗糖0.5％(WN),蛋白胨1.0％(W/V),牛肉膏0.5％(W/V),酵母膏0.1％(W/V);不同無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化:通過(guò)正交試驗(yàn),初步確定堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的最優(yōu)化無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為:檸檬酸三鈉0.7‰(WN),K2HPO4 1.0‰(W/V),KH2PO4 0.4‰(W/V),MgSO4 0.2‰(W/V)。

10、r>　　 美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium sp.)和堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus sp.)在中國(guó)對(duì)蝦腸道中定植效果的比較:在基礎(chǔ)飼料中分別添加分離自健康對(duì)蝦腸道的美人魚發(fā)光桿菌和堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(菌含量不少于1011 CFU/g)的活菌和破碎菌各1g/kg,制備成菌含量不少于108 CFU/g的四組免疫飼料,做為免疫實(shí)驗(yàn)組。免疫實(shí)驗(yàn)10d后,對(duì)其腸道細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng),并進(jìn)行16S rRNA測(cè)序、鑒定,研究不同時(shí)間內(nèi)這株益生

11、菌對(duì)蝦腸道內(nèi)定植的情況。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中,飼料中添加美人魚發(fā)光桿菌的免疫組,通過(guò)對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫10d后腸道優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng),并進(jìn)行16S rRNA測(cè)序、鑒定,結(jié)果為假單胞菌屬(1.5×107 cfu/g),與假單胞菌屬比對(duì)(GenBank Accession No.GU396287),相似度為100％,占腸道細(xì)菌總數(shù)的80％;飼料中添加堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的免疫組,鑒定結(jié)果為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(2.67×108 cfu/g),與堅(jiān)強(qiáng)芽孢