基于細(xì)胞培養(yǎng)篩選抗對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)中草藥及其實(shí)驗(yàn)效果評(píng)價(jià).pdf

1、隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，對(duì)蝦病毒病大范圍暴發(fā)，探索對(duì)蝦病毒的感染機(jī)制、致病機(jī)理、傳播途徑等是防止其進(jìn)一步曼延的基礎(chǔ)，盡管?chē)?guó)內(nèi)外許多專(zhuān)家學(xué)者在對(duì)蝦病毒性疾病防控技術(shù)上做出了不懈的努力，取得了一定的研究成果，但對(duì)蝦疾病并未取得理想的防治效果。目前，隨著細(xì)胞分子生物學(xué)、基因工程、計(jì)算機(jī)技術(shù)等學(xué)科的發(fā)展，出現(xiàn)了高效、快速的藥物篩選模型，在新藥的篩選和研發(fā)中發(fā)揮了積極的作用。結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)篩選有抗對(duì)蝦白斑綜合征病毒作用的中草藥，

2、防止對(duì)蝦病毒性疾病的大肆傳播，將為對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的快速穩(wěn)定發(fā)展提供有力的技術(shù)支持。
　　1.刀額新對(duì)蝦原代淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及其感染白斑綜合征病毒（WSSV）的病理特征
　　配制改良的1.5×L-15培養(yǎng)基對(duì)刀額新對(duì)蝦（Metapenaeus ensis，又名基圍蝦）淋巴組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，初步建立藥物篩選的細(xì)胞平臺(tái)。同時(shí)，使用蔗糖密度離心法提取WSSV病毒粒子，以純化的病毒感染淋巴細(xì)胞，倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡下觀察接種

3、病毒后細(xì)胞的病理變化，為藥物篩選提供判斷依據(jù)。結(jié)果表明，使用添加SME、FBS、EGF、bFGF、青霉素鈉和硫酸鏈霉素的1.5×L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)刀額新對(duì)蝦淋巴細(xì)胞，組織干貼3h以后可觀察到有細(xì)胞從組織塊中遷出，36 h后細(xì)胞的遷出匯合率可達(dá)80％，且單層細(xì)胞能維持20 d以上。待淋巴細(xì)胞形成單層后，接種純化的WSSV，24 h后，出現(xiàn)病變的細(xì)胞變圓、漂浮，細(xì)胞之間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，最后細(xì)胞破碎、溶解；接種WSSV48 h后Hoechst

4、33342染色結(jié)果顯示，感染的細(xì)胞核深染，且變形、膨大；電鏡下，細(xì)胞核內(nèi)含大量成簇分布的桿狀病毒，細(xì)胞器被擠向細(xì)胞邊緣，細(xì)胞膜輪廓模糊。
　　2.抗對(duì)蝦白斑綜合征病毒中草藥的初步篩選
　　建立抗病毒中草藥細(xì)胞水平篩選模型，篩選具有抗WSSV作用的中草藥。利用傳統(tǒng)的水提取方法提取中草藥的有效成分，過(guò)濾、離心、除菌后與純化的WSSV病毒粒子混合，將混合液接種淋巴細(xì)胞，收集出現(xiàn)病理變化的細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA的提取，合成WSSV的熒

5、光定量引物，構(gòu)建重組質(zhì)粒作為絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品，列標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程y=-3.475x+28.92，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴(kuò)增效率E=0.94，對(duì)WSSV進(jìn)行絕對(duì)定量分析，計(jì)算各樣品中病毒粒子單位質(zhì)量拷貝數(shù)，通過(guò)觀察細(xì)胞的病理變化和病毒拷貝數(shù)的差異判斷藥物對(duì)病毒的直接滅活作用，來(lái)篩選具有抗WSSV作用的單方中草藥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AWH-2、AWH-8、AWH-12、AWH-16、AWH-22、AWH-30中草藥具有抗WSSV作用，猜測(cè)可能阻斷了

6、病毒的吸附增殖從而起到了抗病毒效果。
　　3.抗對(duì)蝦白斑綜合征病毒復(fù)方中草藥的篩選及臨床驗(yàn)證
　　2倍梯度稀釋具有抗病毒作用的單方中草藥，接種淋巴細(xì)胞后觀察細(xì)胞的病理變化，確定藥物對(duì)于細(xì)胞的最大安全濃度。結(jié)果顯示，AWH-2、AWH-8、AWH-12、AWH-16、AWH-22、AWH-30中草藥的最大安全濃度分別為25 mg/mL、6.25 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/

7、mL。在中草藥最大安全濃度下以相同百分比的量混合，接種單層淋巴細(xì)胞，初步確定有抗病毒作用的最佳復(fù)方中草藥。將篩選出的復(fù)方中草藥應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)，通過(guò)觀察對(duì)蝦的攝食、游動(dòng)、體色變化、死亡情況判斷其作用效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中草藥的體內(nèi)與體外抗病毒研究結(jié)果基本一致。
　　綜上所述，本文以改良的1.5×L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)刀額新對(duì)蝦淋巴細(xì)胞，待遷出細(xì)胞形成單層后接種純化的WSSV，建立體外抗病毒藥物篩選模型。以病毒引起細(xì)胞的病理變化及病毒在細(xì)