中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)抗白斑綜合征病毒(WSSV)候選基因分析.pdf

1、中國對蝦是我國主要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種,二十世紀(jì)九十年代白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)暴發(fā)以來其產(chǎn)業(yè)受到嚴(yán)重影響。近年來隨著種苗和養(yǎng)殖水平整體的提高,我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)逐年發(fā)展。但時(shí)至今日,WSSV依舊是影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病原之一。從根本上解決對蝦養(yǎng)殖業(yè)中WSSV等問題的關(guān)鍵是選育出抗病能力強(qiáng)和生長速度快等優(yōu)良性狀兼顧的中國對蝦新品種。對于閾性狀和低遺傳力性狀,將傳統(tǒng)選育手段和先進(jìn)的分子生物學(xué)

2、技術(shù)相結(jié)合,能提高選擇準(zhǔn)確性,加快育種進(jìn)程。本研究以中國對蝦“黃海2號”454轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),以RACE、基因克隆、常規(guī)測序、HRM、ELISA、real-time PCR等常規(guī)生物學(xué)技術(shù)為平臺(tái),進(jìn)行中國對蝦抗WSSV性狀候選基因和SNP分析,為中國對蝦抗WSSV育種提供理論依據(jù)和實(shí)踐材料。主要研究包括首次獲得中國對蝦MEK、ERK、Ras和組織蛋白酶B基因序列;開發(fā)、分析各基因內(nèi)SNP位點(diǎn);進(jìn)行正常中國對蝦和感染W(wǎng)SSV的中國對

3、蝦不同組織內(nèi)各基因表達(dá)水平分析;感染中國對蝦WSSV復(fù)制特點(diǎn)以及抑制中國對蝦MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對WSSV復(fù)制水平影響;挑選454轉(zhuǎn)錄組測序中的候選SNP位點(diǎn);利用HRM技術(shù)在抗病組和敏感組內(nèi)進(jìn)行基因分型,統(tǒng)計(jì)遺傳多態(tài)性信息和進(jìn)行抗病關(guān)聯(lián)分析等。具體內(nèi)容包括:
　　1、報(bào)道了中國對蝦 MEK(FcMEK)mRNA序列(序列上傳至 GenBank,登錄號為KJ135020)并發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)受WSSV感染的影響。感染W(wǎng)SSV的中

4、國對蝦,FcMEK mRNA在肝胰腺中6 h和48 h呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá),12 h和24 h轉(zhuǎn)錄水平下降。FcMEK mRNA在鰓中12 h、24 h和48 h轉(zhuǎn)錄水平上升,6 h轉(zhuǎn)錄水平下降。FcMEK mRNA在肌肉中6 h、12 h、24 h和48 h轉(zhuǎn)錄水平上升。結(jié)果提示FcMEK表達(dá)受WSSV感染影響。通過常規(guī)測序技術(shù)在FcMEK mRNA ORF內(nèi)發(fā)現(xiàn)三個(gè)SNP位點(diǎn),分別位于ORF的第762 bp、765 bp和972 bp處。三

5、個(gè)SNP突變位點(diǎn)都是C/T轉(zhuǎn)換,分別命名為C-762T、C-765T和C-972T。結(jié)果表明C-762T和C-765T位點(diǎn)位于同一個(gè)單倍型。利用HRM技術(shù)進(jìn)一步對中國對蝦抗病組和敏感組內(nèi)上述三個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,C-762T和C-765T突變位點(diǎn)得到可讀峰圖,提示附近沒有內(nèi)含子存在?？共〗M內(nèi)C-762T和C-765T突變位點(diǎn)Ho為0.604,He為0.424,MAF為0.302。敏感組內(nèi)C-762T和C-765T突變位點(diǎn)Ho為0.

6、583,He為0.424,MAF為0.302。C-762T和C-765T突變位點(diǎn)在兩組內(nèi)都偏離HWE,但進(jìn)一步的抗病組和敏感組卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明,兩個(gè)組間的基因型分布沒有顯著差異。偏離HWE提示在整個(gè)中國對蝦“黃海2號”選育群體中該位點(diǎn)有可能受到了選擇。
　　2、報(bào)道了中國對蝦ERK(FcERK)mRNA序列(序列上傳至GenBank,登錄號為KC537791)并發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)受WSSV感染的影響。感染W(wǎng)SSV的中國對蝦,FcERK

7、 mRNA在肝胰腺中6 h、12 h、24 h和48 h轉(zhuǎn)錄水平下降。FcERK mRNA在鰓中6 h、12 h和24 h轉(zhuǎn)錄水平上升,48 h轉(zhuǎn)錄水平下降。FcERK mRNA在肌肉中48 h轉(zhuǎn)錄水平上升,6至24 h呈現(xiàn)小幅波動(dòng)變化趨勢。肝胰腺中FcERK蛋白從3 h到24 h呈現(xiàn)緩慢升高趨勢,至48 h下降。3 h、12 h和48 h鰓中FcERK蛋白水平上升,在6 h和24 h下降。12 h和48 h肌肉中FcERK蛋白水平上升

8、,3 h、6 h和24 h下降。感染W(wǎng)SSV后FcERK表達(dá)水平的變化提示其受到WSSV感染過程影響。在FcERK mRNA ORF內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn),在3’ UTR內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn),都是C/T轉(zhuǎn)換,分別命名為C-544T、C-1133。利用HRM技術(shù)對中國對蝦抗病組和敏感組內(nèi)上述兩個(gè) SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,抗病組內(nèi)C-544T突變位點(diǎn)Ho為0.146,He為0.154,MAF為0.083。敏感組內(nèi)C-544T突變位點(diǎn)Ho為0.

9、208,He為0.204,MAF為0.115。抗病組內(nèi)C-1133T突變位點(diǎn)Ho為0.177,He為0.162,MAF為0.089。敏感組內(nèi)C-1133T突變位點(diǎn)Ho為0.156, He為0.145,MAF為0.078。兩個(gè)SNP位點(diǎn)在兩組內(nèi)都符合HWE,且兩組間基因型分布沒有顯著差異,雖然本研究結(jié)果提示FcERK可能參與中國對蝦抗WSSV過程,但基因內(nèi)兩個(gè)突變位點(diǎn)并沒有影響FcERK在抗WSSV過程中的作用。上述兩個(gè)SNP位點(diǎn)的MAF

10、都遠(yuǎn)大于0.05,適合進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要激酶,FcERK內(nèi)SNP位點(diǎn)值得深入研究。
　　3、本研究發(fā)現(xiàn)感染W(wǎng)SSV后死亡的中國對蝦,后期死亡個(gè)體病毒含量高于早期死亡個(gè)體,提示對蝦抗 WSSV性能從一方面體現(xiàn)在耐受病毒數(shù)量上,因此以育種目的來講,除了能耐受更多病毒的感染,抑制病毒復(fù)制速度,甚至是殺滅病毒的能力,是對蝦能最終存活下來的關(guān)鍵,另外研發(fā)新藥物來抑制宿主體內(nèi)病毒復(fù)制能力也能提高染病對蝦存活率。利用MEK的

11、特異抑制劑U0126抑制中國對蝦MEK/ERK通路活性后,檢測感染宿主的WSSV復(fù)制水平。與對照組相比,添加U0126的實(shí)驗(yàn)組中WSSV復(fù)制水平受到抑制,24 h實(shí)驗(yàn)組WSSV復(fù)制水平約為對照組的五分之二;48 h實(shí)驗(yàn)組WSSV復(fù)制水平約為對照組的五分之三。綜合本研究中對于FcMEK和FcERK基因在感染W(wǎng)SSV的中國對蝦不同組織內(nèi)表達(dá)變化的研究結(jié)果,提示W(wǎng)SSV在感染中國對蝦時(shí)需挾持宿主MEK/ERK通路用于其自身復(fù)制。
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12、、報(bào)道了中國對蝦Ras基因(FcRas)mRNA序列(序列上傳至GenBank,登錄號KC522602)并發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)受WSSV感染的影響。感染W(wǎng)SSV的中國對蝦,FcRas mRNA在肝胰腺中6 h和48 h轉(zhuǎn)錄水平上升,12 h和24 h轉(zhuǎn)錄水平下降。FcRas mRNA在鰓和肌肉組織中6 h、12 h、24 h和48 h都呈上調(diào)表達(dá)。感染W(wǎng)SSV后轉(zhuǎn)錄水平的明顯變化提示FcRas受到WSSV感染的影響。對26只中國對蝦FcRas

13、 mRNA測序結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn),是本文所研究的五個(gè)基因中唯一一個(gè)沒有發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)的基因,從一個(gè)方面也提示Ras基因高度保守性的特點(diǎn)。
　　5、報(bào)道了中國對蝦組織蛋白酶B(FcCathepsin B)mRNA序列(序列上傳至GenBank,登錄號為KC537790)并發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)受WSSV感染的影響。感染W(wǎng)SSV的中國對蝦,FcCathepsin B mRNA在肝胰腺中6 h和48 h轉(zhuǎn)錄水平上升,12 h和24 h轉(zhuǎn)錄水

14、平下降。FcCathepsin B mRNA在鰓中6 h、12 h和24 h轉(zhuǎn)錄水平上升,48 h轉(zhuǎn)錄水平下降。FcCathepsin B mRNA在肌肉中6 h、12 h和48 h轉(zhuǎn)錄水平上升,24 h略微下降。感染W(wǎng)SSV后轉(zhuǎn)錄水平的明顯變化提示其受到WSSV感染過程影響。在FcCathepsin B ORF內(nèi)發(fā)現(xiàn)三個(gè)SNP,分別位于ORF第42 bp、756 bp和984 bp,三個(gè)SNP位點(diǎn)都是C/T轉(zhuǎn)換,并命名為C-42T、C

15、-756T和C-984T。結(jié)果表明該三個(gè)SNP位于同一個(gè)單倍型。利用HRM技術(shù)進(jìn)一步對抗病組和敏感組進(jìn)行SNP基因分型,C-984T突變位點(diǎn)處有可讀峰圖,提示其周圍沒有內(nèi)含子存在?？共〗M中C-984T突變位點(diǎn)的Ho為0.375,He為0.344,MAF為0.219。敏感組中C-984T突變位點(diǎn)的Ho為0.417,He為0.355,MAF為0.229。該SNP位點(diǎn)在兩組內(nèi)都符合HWE,且基因型分布沒有顯著差異,說明該SNP位點(diǎn)并沒有影響基

16、因在抗WSSV過程中的作用。上述SNP的MAF遠(yuǎn)大于0.05,適合進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
　　6、利用HRM技術(shù)對中國對蝦“黃海2號”454轉(zhuǎn)錄組測序中的候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證和分析,81個(gè)SNP位點(diǎn)得以確認(rèn),且發(fā)現(xiàn)1個(gè)抗病相關(guān)位點(diǎn)。本研究挑選480個(gè)候選SNP位點(diǎn),設(shè)計(jì)相應(yīng)HRM引物480對,經(jīng)驗(yàn)證其中合格引物243對。設(shè)計(jì)相應(yīng)非標(biāo)計(jì)探針,通過HRM實(shí)驗(yàn)對中國對蝦抗病組和敏感組進(jìn)行基因分型,共有81個(gè)位點(diǎn)確認(rèn)為SNP,并統(tǒng)計(jì)Ho、He、

17、Ne、MAF、I、HWE信息。81個(gè)SNP位點(diǎn)在抗病組中有55個(gè)位點(diǎn)MAF大于0.05,在敏感組中有56個(gè)位點(diǎn) MAF大于0.05,這些 SNP位點(diǎn)的多態(tài)性較高,適合進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。81個(gè)SNP位點(diǎn)在抗病組中有65個(gè)符合HWE,敏感組中有60個(gè)符合HWE。在81個(gè)SNP位點(diǎn)中,A/C突變4個(gè),A/G突變27個(gè),A/T突變11個(gè),C/G突變9個(gè),C/T突變28個(gè),T/G突變2個(gè),轉(zhuǎn)換/顛換=2.115,符合“transition bias”

18、原理。通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)312C1298-154C/T突變位點(diǎn)的C/C基因型在2011年和2012年抗病組和敏感組中都差異分布,提示該位點(diǎn)與抗 WSSV性狀相關(guān)。通過基因克隆技術(shù)獲得該抗病相關(guān)SNP位點(diǎn)所在基因,為磷酸丙酮酸水合酶,命名為FcPH(序列上傳至GenBank,登錄號KJ649284)。FcPH mRNA ORF長1305 bp,編碼434氨基酸。利用real-time PCR檢測該基因表達(dá)水平在感染W(wǎng)SSV的中國對蝦鰓和肌肉