中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)抗白斑綜合征病毒(WSSV)候選基因分析.pdf

1、中國對蝦是我國主要的經濟水產養(yǎng)殖品種,二十世紀九十年代白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)暴發(fā)以來其產業(yè)受到嚴重影響。近年來隨著種苗和養(yǎng)殖水平整體的提高,我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)逐年發(fā)展。但時至今日,WSSV依舊是影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病原之一。從根本上解決對蝦養(yǎng)殖業(yè)中WSSV等問題的關鍵是選育出抗病能力強和生長速度快等優(yōu)良性狀兼顧的中國對蝦新品種。對于閾性狀和低遺傳力性狀,將傳統(tǒng)選育手段和先進的分子生物學

2、技術相結合,能提高選擇準確性,加快育種進程。本研究以中國對蝦“黃海2號”454轉錄組測序數(shù)據(jù)為基礎,以RACE、基因克隆、常規(guī)測序、HRM、ELISA、real-time PCR等常規(guī)生物學技術為平臺,進行中國對蝦抗WSSV性狀候選基因和SNP分析,為中國對蝦抗WSSV育種提供理論依據(jù)和實踐材料。主要研究包括首次獲得中國對蝦MEK、ERK、Ras和組織蛋白酶B基因序列;開發(fā)、分析各基因內SNP位點;進行正常中國對蝦和感染WSSV的中國對

3、蝦不同組織內各基因表達水平分析;感染中國對蝦WSSV復制特點以及抑制中國對蝦MEK/ERK信號轉導通路對WSSV復制水平影響;挑選454轉錄組測序中的候選SNP位點;利用HRM技術在抗病組和敏感組內進行基因分型,統(tǒng)計遺傳多態(tài)性信息和進行抗病關聯(lián)分析等。具體內容包括:
　　1、報道了中國對蝦 MEK(FcMEK)mRNA序列(序列上傳至 GenBank,登錄號為KJ135020)并發(fā)現(xiàn)該基因表達受WSSV感染的影響。感染WSSV的中

4、國對蝦,FcMEK mRNA在肝胰腺中6 h和48 h呈現(xiàn)上調表達,12 h和24 h轉錄水平下降。FcMEK mRNA在鰓中12 h、24 h和48 h轉錄水平上升,6 h轉錄水平下降。FcMEK mRNA在肌肉中6 h、12 h、24 h和48 h轉錄水平上升。結果提示FcMEK表達受WSSV感染影響。通過常規(guī)測序技術在FcMEK mRNA ORF內發(fā)現(xiàn)三個SNP位點,分別位于ORF的第762 bp、765 bp和972 bp處。三

5、個SNP突變位點都是C/T轉換,分別命名為C-762T、C-765T和C-972T。結果表明C-762T和C-765T位點位于同一個單倍型。利用HRM技術進一步對中國對蝦抗病組和敏感組內上述三個SNP位點進行基因分型,C-762T和C-765T突變位點得到可讀峰圖,提示附近沒有內含子存在?？共〗M內C-762T和C-765T突變位點Ho為0.604,He為0.424,MAF為0.302。敏感組內C-762T和C-765T突變位點Ho為0.

6、583,He為0.424,MAF為0.302。C-762T和C-765T突變位點在兩組內都偏離HWE,但進一步的抗病組和敏感組卡方檢驗結果表明,兩個組間的基因型分布沒有顯著差異。偏離HWE提示在整個中國對蝦“黃海2號”選育群體中該位點有可能受到了選擇。
　　2、報道了中國對蝦ERK(FcERK)mRNA序列(序列上傳至GenBank,登錄號為KC537791)并發(fā)現(xiàn)該基因表達受WSSV感染的影響。感染WSSV的中國對蝦,FcERK

7、 mRNA在肝胰腺中6 h、12 h、24 h和48 h轉錄水平下降。FcERK mRNA在鰓中6 h、12 h和24 h轉錄水平上升,48 h轉錄水平下降。FcERK mRNA在肌肉中48 h轉錄水平上升,6至24 h呈現(xiàn)小幅波動變化趨勢。肝胰腺中FcERK蛋白從3 h到24 h呈現(xiàn)緩慢升高趨勢,至48 h下降。3 h、12 h和48 h鰓中FcERK蛋白水平上升,在6 h和24 h下降。12 h和48 h肌肉中FcERK蛋白水平上升

8、,3 h、6 h和24 h下降。感染WSSV后FcERK表達水平的變化提示其受到WSSV感染過程影響。在FcERK mRNA ORF內發(fā)現(xiàn)一個SNP位點,在3’ UTR內發(fā)現(xiàn)一個SNP位點,都是C/T轉換,分別命名為C-544T、C-1133。利用HRM技術對中國對蝦抗病組和敏感組內上述兩個 SNP位點進行基因分型,抗病組內C-544T突變位點Ho為0.146,He為0.154,MAF為0.083。敏感組內C-544T突變位點Ho為0.

9、208,He為0.204,MAF為0.115?？共〗M內C-1133T突變位點Ho為0.177,He為0.162,MAF為0.089。敏感組內C-1133T突變位點Ho為0.156, He為0.145,MAF為0.078。兩個SNP位點在兩組內都符合HWE,且兩組間基因型分布沒有顯著差異,雖然本研究結果提示FcERK可能參與中國對蝦抗WSSV過程,但基因內兩個突變位點并沒有影響FcERK在抗WSSV過程中的作用。上述兩個SNP位點的MAF

10、都遠大于0.05,適合進行關聯(lián)分析,作為信號轉導通路中的重要激酶,FcERK內SNP位點值得深入研究。
　　3、本研究發(fā)現(xiàn)感染WSSV后死亡的中國對蝦,后期死亡個體病毒含量高于早期死亡個體,提示對蝦抗 WSSV性能從一方面體現(xiàn)在耐受病毒數(shù)量上,因此以育種目的來講,除了能耐受更多病毒的感染,抑制病毒復制速度,甚至是殺滅病毒的能力,是對蝦能最終存活下來的關鍵,另外研發(fā)新藥物來抑制宿主體內病毒復制能力也能提高染病對蝦存活率。利用MEK的

11、特異抑制劑U0126抑制中國對蝦MEK/ERK通路活性后,檢測感染宿主的WSSV復制水平。與對照組相比,添加U0126的實驗組中WSSV復制水平受到抑制,24 h實驗組WSSV復制水平約為對照組的五分之二;48 h實驗組WSSV復制水平約為對照組的五分之三。綜合本研究中對于FcMEK和FcERK基因在感染WSSV的中國對蝦不同組織內表達變化的研究結果,提示WSSV在感染中國對蝦時需挾持宿主MEK/ERK通路用于其自身復制。
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12、、報道了中國對蝦Ras基因(FcRas)mRNA序列(序列上傳至GenBank,登錄號KC522602)并發(fā)現(xiàn)該基因表達受WSSV感染的影響。感染WSSV的中國對蝦,FcRas mRNA在肝胰腺中6 h和48 h轉錄水平上升,12 h和24 h轉錄水平下降。FcRas mRNA在鰓和肌肉組織中6 h、12 h、24 h和48 h都呈上調表達。感染WSSV后轉錄水平的明顯變化提示FcRas受到WSSV感染的影響。對26只中國對蝦FcRas

13、 mRNA測序結果中未發(fā)現(xiàn)SNP位點,是本文所研究的五個基因中唯一一個沒有發(fā)現(xiàn)SNP位點的基因,從一個方面也提示Ras基因高度保守性的特點。
　　5、報道了中國對蝦組織蛋白酶B(FcCathepsin B)mRNA序列(序列上傳至GenBank,登錄號為KC537790)并發(fā)現(xiàn)該基因表達受WSSV感染的影響。感染WSSV的中國對蝦,FcCathepsin B mRNA在肝胰腺中6 h和48 h轉錄水平上升,12 h和24 h轉錄水

14、平下降。FcCathepsin B mRNA在鰓中6 h、12 h和24 h轉錄水平上升,48 h轉錄水平下降。FcCathepsin B mRNA在肌肉中6 h、12 h和48 h轉錄水平上升,24 h略微下降。感染WSSV后轉錄水平的明顯變化提示其受到WSSV感染過程影響。在FcCathepsin B ORF內發(fā)現(xiàn)三個SNP,分別位于ORF第42 bp、756 bp和984 bp,三個SNP位點都是C/T轉換,并命名為C-42T、C

15、-756T和C-984T。結果表明該三個SNP位于同一個單倍型。利用HRM技術進一步對抗病組和敏感組進行SNP基因分型,C-984T突變位點處有可讀峰圖,提示其周圍沒有內含子存在?？共〗M中C-984T突變位點的Ho為0.375,He為0.344,MAF為0.219。敏感組中C-984T突變位點的Ho為0.417,He為0.355,MAF為0.229。該SNP位點在兩組內都符合HWE,且基因型分布沒有顯著差異,說明該SNP位點并沒有影響基

16、因在抗WSSV過程中的作用。上述SNP的MAF遠大于0.05,適合進行關聯(lián)分析。
　　6、利用HRM技術對中國對蝦“黃海2號”454轉錄組測序中的候選SNP位點進行驗證和分析,81個SNP位點得以確認,且發(fā)現(xiàn)1個抗病相關位點。本研究挑選480個候選SNP位點,設計相應HRM引物480對,經驗證其中合格引物243對。設計相應非標計探針,通過HRM實驗對中國對蝦抗病組和敏感組進行基因分型,共有81個位點確認為SNP,并統(tǒng)計Ho、He、

17、Ne、MAF、I、HWE信息。81個SNP位點在抗病組中有55個位點MAF大于0.05,在敏感組中有56個位點 MAF大于0.05,這些 SNP位點的多態(tài)性較高,適合進行關聯(lián)分析。81個SNP位點在抗病組中有65個符合HWE,敏感組中有60個符合HWE。在81個SNP位點中,A/C突變4個,A/G突變27個,A/T突變11個,C/G突變9個,C/T突變28個,T/G突變2個,轉換/顛換=2.115,符合“transition bias”

18、原理。通過關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)312C1298-154C/T突變位點的C/C基因型在2011年和2012年抗病組和敏感組中都差異分布,提示該位點與抗 WSSV性狀相關。通過基因克隆技術獲得該抗病相關SNP位點所在基因,為磷酸丙酮酸水合酶,命名為FcPH(序列上傳至GenBank,登錄號KJ649284)。FcPH mRNA ORF長1305 bp,編碼434氨基酸。利用real-time PCR檢測該基因表達水平在感染WSSV的中國對蝦鰓和肌肉