表達(dá)VP28枯草工程菌的構(gòu)建及抗對蝦白斑綜合征病毒機制的初步研究.pdf

1、對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)可引起養(yǎng)殖對蝦的急性、致死性傳染病,造成世界范圍內(nèi)對蝦養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟損失。WSSV已成為威脅我國乃至世界對蝦健康養(yǎng)殖的重要病原。本研究以WSSV最豐富的囊膜蛋白VP28為靶蛋白構(gòu)建VP28抗原蛋白枯草工程菌(B.subtilis-VP28);在此基礎(chǔ)上對重組菌株芽孢體和營養(yǎng)體進(jìn)行模擬胃腸道環(huán)境和高溫環(huán)境的耐受性評估以研究產(chǎn)業(yè)化最合適的劑型;同時免疫對蝦后檢測免疫基因(proPO,PE和LGBP)mRNA表

2、達(dá)水平和細(xì)胞吞噬WSSV活性的變化;并檢測其在腸道內(nèi)的存活和體內(nèi)的定位分布,從對對蝦非特異性免疫機制的影響和口服遞呈途徑來初步探究B.subtilis-VP28的抗病機理。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.表達(dá)VP28的枯草芽孢桿菌(B.subtilis-VP28)的構(gòu)建
　　 在含群體感應(yīng)啟動子LuxⅠ(源自NF003)和木聚肽糖酶信號肽xynA的高效表達(dá)重組質(zhì)粒PW980(來源于B.subtilis pUB110)

3、基礎(chǔ)上,利用雙酶切位點:PstⅠ、SalⅠ引入VP28基因,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PW980-VP28,經(jīng)雙酶切和測序鑒定,證明VP28基因己成功插入到重組質(zhì)粒PW980中。將B.subtilis1A751作為宿主菌,采用化學(xué)法制備感受態(tài)細(xì)胞,成功將表達(dá)VP28的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入B.subtilis1A751中,經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)酵24h的B.subtilis-VP28上清液,在28KD左右有一明顯的條帶,與預(yù)計大小一致。表明VP28基因在

4、B.subtilis1A751成功獲得胞外分泌表達(dá)。
　　 2.重組菌株B.subtilis-VP28的耐受性評估
　　 用體外模擬胃腸道環(huán)境與芽孢存活計數(shù)相結(jié)合手段,考察重組菌株B.subtilis-VP28營養(yǎng)體和芽孢體耐受對蝦胃腸道環(huán)境和高溫環(huán)境的能力。試驗結(jié)果表明:①重組菌株B.subtilis-VP28芽孢在不同的pH環(huán)境中都表現(xiàn)出很強的耐受性和良好的生長增殖趨勢,而營養(yǎng)體的耐受性較差;②在含不同濃度胰蛋白酶的

5、模擬腸液中芽孢和營養(yǎng)體均能表現(xiàn)出良好的耐受性,其中芽孢的耐受能力更為顯著;③當(dāng)溫度高達(dá)80℃時,仍有93.9％的芽孢存活,而營養(yǎng)體基本失活。這些特點使重組菌株B.subtilis-VP28芽孢體可成為口服疫苗遞呈VP28至胃腸等極端環(huán)境的理想劑型。
　　 3.重組菌株B.subtilis-VP28免疫對蝦后對免疫基因mRNA表達(dá)水平和細(xì)胞吞噬活性的影響
　　 重組菌株B.subtilis-VP28免疫凡納淀對蝦,同時設(shè)立

6、B.subtilis-VP28發(fā)酵上清液(主要是VP28);B.subtilis;NaCl對照組,采用SYBR Green I熒光定量PCR檢測免疫基因proPO,PE和LGBPmRNA的表達(dá)水平,同時采用FITC標(biāo)記的WSSV進(jìn)行血細(xì)胞吞噬WSSV活性的檢測,進(jìn)一步揭示B.subtilis-VP28表達(dá)系統(tǒng)對對蝦非特異性免疫的影響。試驗結(jié)果表明:在免疫后的第3d.B.subtilis-VP28菌液能顯著影響對蝦proPO,PE和LGB

7、P mRNA的表達(dá)水平和細(xì)胞對WSSV的吞噬活性,B.subtilis菌液組相比較B.subtilis-VP28發(fā)酵上清液組也對proPO,PE和LGBP免疫基因和細(xì)胞吞噬活性有一定的增強作用,NaCl組則基本沒有變化。說明重組菌株B.subtilis-VP28能激發(fā)對蝦的非特異性免疫應(yīng)答,而枯草芽孢桿菌系統(tǒng)本身作為益生菌對對蝦的免疫機制也有一定的激活作用。
　　 4.重組菌株B.subtilis-VP28在對蝦腸道內(nèi)的存活和體

8、內(nèi)的定位分布
　　 利用VP28蛋白的抗原特異性和芽孢的耐熱性,對蝦口服免疫重組菌株芽孢后,用計數(shù)法對其腸道內(nèi)容物進(jìn)行芽孢定植存活情況的檢測,同時制作腸道,腺體,心臟和肌肉的冰凍切片,采用免疫熒光染色方法并結(jié)合PCR方法和芽孢計數(shù)方法研究重組菌株B.subtilis-VP28在對蝦體內(nèi)的遞呈情況。結(jié)果顯示:免疫對蝦第7d后在其的腸道內(nèi)容物中仍能檢測到大量的活芽孢,說明芽孢在對蝦腸道內(nèi)是可以存活并生長定植的。三種方法顯示對蝦免疫3