以枯草芽孢桿菌遞呈對蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28對凡納對蝦抗病毒免疫保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、對蝦白斑綜合征病毒(WhiteSpotSyndromeVirus，WSSV)傳染性強(qiáng)、宿主范圍廣、致死率高，是我國及世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)生爆發(fā)性流行病的主要病原，嚴(yán)重制約著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本課題組前期實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)WSSV囊膜蛋白-VP28的重組工程菌(B.subtilis-VP28)，并研究發(fā)現(xiàn)了該菌株能顯著提高攻毒后的中國對蝦和螯蝦存活率并且能特異性保護(hù)機(jī)體抗WSSV感染，但此免疫保護(hù)機(jī)制還不甚清楚。本課題在此基礎(chǔ)上，通過口服

2、重組菌株B.subtilis-VP28免疫凡納對蝦，研究B.subtilis-VP28對凡納對蝦抗WSSV感染的保護(hù)效果及免疫功能的影響，并克隆分析與對蝦適應(yīng)性免疫相關(guān)的免疫球蛋白超家族分子Dscam可變區(qū)序列，從Dscam識別與細(xì)胞吞噬途徑探討重組菌B.subtilis-VP28誘導(dǎo)對蝦特異性抗病毒感染的分子機(jī)制。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.重組菌株B.subtilis-VP28對凡納對蝦體液免疫因子的影響
　　

3、 以芽孢重組菌B.subtilis-VP28作為免疫原口服免疫凡納對蝦，并以B.subtilis和正常健康對蝦作為對照，進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，并取對蝦血清檢測抗菌活力、溶菌活力、酚氧化酶活力、超氧化物歧化酶(SOD)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性和堿性磷酸酶(AKP)活性，另外取對蝦血細(xì)胞抽提總RNA，采用熒光定量PCR方法檢測Toll樣受體、溶菌酶、血藍(lán)蛋白和Dscam基因的mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，B.subtilis-VP28能

4、顯著提高凡納對蝦血清各免疫因子的活性，說明B.subtilis-VP28對凡納對蝦機(jī)體的體液免疫功能具有顯著的增強(qiáng)作用。此外，B.subtilis-VP28還能顯著提高Toll樣受體、溶菌酶、血藍(lán)蛋白和Dscam基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，揭示B.subtilis-VP28能夠介導(dǎo)凡納對蝦機(jī)體啟動免疫應(yīng)答反應(yīng)并釋放免疫因子。
　　 2.重組菌株B.subtilis-VP28對凡納對蝦血淋巴細(xì)胞特異性吞噬的影響
　　 將重組菌

5、株B.subtilis-VP28的芽孢形式和海藻多糖口服投喂免疫凡納對蝦28d，并以B.subtilis和正常健康組作對照，分別在免疫4d、7d、14d、28d后，檢測不同試驗(yàn)組凡納對蝦血細(xì)胞吞噬活性。另外分別在免疫4d、14d、28d后，差異分析各試驗(yàn)組血細(xì)胞對不同抗原（WSSV和弧菌）的吞噬功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在免疫不同時間內(nèi)，B.subtilis-VP28均能顯著提高凡納對蝦血細(xì)胞吞噬WSSV功能，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫。此外，

6、在不同免疫時間內(nèi)，B.subtilis-VP28能顯著提高血細(xì)胞對WSSV的吞噬（與其對弧菌的吞噬能力相比）;而B.subtilis組和海藻多糖組的對蝦血細(xì)胞對吞噬WSSV和弧菌不存在顯著性差異。說明B.subtilis-VP28具有誘導(dǎo)凡納對蝦血細(xì)胞特異性吞噬WSSV的作用，揭示B.subtilis-VP28可通過引發(fā)凡納對蝦血細(xì)胞特異性吞噬作用介導(dǎo)機(jī)體的特異性抗病毒感染。
　　 3.凡納對蝦Dscam選擇性剪接外顯子位點(diǎn)鑒別

7、及可變區(qū)序列分析
　　 根據(jù)Genbank公布的凡納對蝦Dscam(LvDscam)的cDNA序列，分別以該基因的免疫球蛋白區(qū)和粘連蛋白區(qū)序列設(shè)計特異性引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增、克隆及測序后，由多重序列比對得知:LvDscam存在3個選擇性剪接外顯子，分別位于Ig2-N（126-177aa）、Ig3-N(228-268aa)和整個Ig7區(qū)(603-698aa)。正常情況下LvDscam可通過RNA選擇性剪接機(jī)制產(chǎn)生3個Ig2-N區(qū)變

8、構(gòu)體、4個Ig3-N區(qū)變構(gòu)體和2個Ig7區(qū)變構(gòu)體，說明LvDscam具有分子多樣性。另外，由系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知:LvDscam在系統(tǒng)發(fā)育樹的無脊椎動物分枝上占據(jù)一個單獨(dú)的進(jìn)化亞單位分枝，預(yù)示著LvDscam可能是一種新型的無脊椎動物Dscam蛋白。
　　 4.差異分析不同免疫原刺激凡納對蝦Dscam特異性變構(gòu)體庫的特征
　　 口服重組菌株B.subtilis-VP28和海藻多糖免疫凡納對蝦28d，并以B.subtilis

9、和正常健康組作對照，根據(jù)LvDscam可變區(qū)序列設(shè)計特異性引物，克隆LvDscam可變區(qū)片段，并隨機(jī)選取15個克隆子送至測序。由多重序列比對得知:B.subtilis-VP28、B.subtilis、海藻多糖共引發(fā)LvDscam產(chǎn)生13個Ig2-N區(qū)變構(gòu)體，15個Ig3-N區(qū)變構(gòu)體和11個Ig7區(qū)變構(gòu)體，預(yù)測可編碼2145(13×15×11=2145)種LvDscam選擇性剪接變構(gòu)體，由此可說明LvDscam具有豐富的分子多樣性。通過組