中國對蝦血細(xì)胞發(fā)生、功能及其白斑綜合征病毒受體蛋白研究.pdf

1、本論文在研制的抗中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)血細(xì)胞單克隆抗體的基礎(chǔ)上，通過間接免疫熒光技術(shù)首次檢測到中國對蝦血細(xì)胞最早出現(xiàn)于肢芽期，大顆粒細(xì)胞最早出現(xiàn)于膜內(nèi)無節(jié)幼體期；通過流式細(xì)胞技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，中國對蝦血細(xì)胞對熒光微球的吞噬率在注射后迅速升高并在6h后達(dá)到最高值，被吞噬的熒光微球在淋巴器官中積累，血細(xì)胞吞噬率在白斑綜合征病毒(WSSV)感染后雖在短時間內(nèi)升高但隨后迅速降低；論文建立了差速離心法提取的中國對

2、蝦血細(xì)胞膜與地高辛標(biāo)記WSSV的Dot-Blot和ELISA體外結(jié)合體系作為篩選體系，從制備的中國對蝦血細(xì)胞膜單克隆抗體中篩選到一株對WSSV具有阻斷作用的單克隆抗體R2H1，為進(jìn)一步研究WSSV與宿主的相互作用機(jī)理提供了基礎(chǔ)。 (1)利用雜交瘤技術(shù)，論文制備了特異性識別中國對蝦所有三類血細(xì)胞的單抗2A3和特異性識別中國對蝦大顆粒血細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)顆粒的單抗1H11。通過對包括囊胚期、原腸胚期、肢芽期、膜內(nèi)無節(jié)幼體期和無節(jié)幼體Ⅰ期在

3、內(nèi)的中國對蝦胚胎的間接免疫熒光檢測，最早在肢芽期胚胎中檢測到2A3陽性信號；在膜內(nèi)無節(jié)幼體期，2A3陽性血細(xì)胞平均直徑約7μm，聚集成簇；在無節(jié)幼體Ⅰ期，血細(xì)胞形態(tài)更加完整清晰，平均直徑已與成體對蝦血細(xì)胞相似。1H11陽性大顆粒細(xì)胞最早在膜內(nèi)無節(jié)幼體期胚胎中出現(xiàn)，這些細(xì)胞同樣成簇存在，在其細(xì)胞質(zhì)外圍可見點(diǎn)狀熒光。在無節(jié)幼體Ⅰ期樣品中，血細(xì)胞總數(shù)和大顆粒細(xì)胞數(shù)量較胚胎期都顯著增加，反映了對蝦免疫系統(tǒng)隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行而加強(qiáng)。 (2

4、)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，健康中國對蝦血細(xì)胞對注射入體內(nèi)的熒光微球的吞噬在注射后迅速升高并在6h后達(dá)到最高點(diǎn)12.58％；隨后該比率逐漸下降，至注射后16h實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，血細(xì)胞吞噬率已下降到4.02％，反映了血細(xì)胞對血淋巴中異物的清除過程。顯微鏡觀察注射微球6h后中國對蝦的外周血細(xì)胞和淋巴器官，發(fā)現(xiàn)主要是半顆粒細(xì)胞執(zhí)行對微球的吞噬，吞噬后的熒光微球在淋巴器官中積累。WSSV感染后第一天，血細(xì)胞吞噬率(14.42％)由于應(yīng)激作用而略高于對照值；

5、隨后，該比率迅速降低并維持在對照值的50％左右(6.12％)；在感染后第六天，血細(xì)胞吞噬率再次上升至11.23％，隨后感染對蝦大量死亡。 (3)論文通過差速離心法提取海捕中國對蝦血細(xì)胞膜，分別利用Dot-Blot和ELISA技術(shù)，使地高辛(DIG)標(biāo)記的WSSV與之4℃結(jié)合4h并以抗DIG抗體作為探針檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆為陽性，證明體外環(huán)境下WSSV能穩(wěn)定地與血細(xì)胞膜結(jié)合。以抗中國對蝦血細(xì)胞膜多克隆抗體37℃孵育血細(xì)胞膜1h，能夠阻