對蝦白斑綜合征病毒和黃頭病毒等溫擴(kuò)增檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、近年來，水產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，已逐漸成為中國農(nóng)業(yè)中發(fā)展較快的產(chǎn)業(yè)之一，在全球水產(chǎn)總量中占有舉足輕重的地位。但在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模不斷壯大的同時，各種病害也隨之而來。對蝦養(yǎng)殖業(yè)作為我國海水養(yǎng)殖業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，也深受多種病害困擾，我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)每年因?qū)ξr病害流行造成的損失高達(dá)數(shù)十億元。利用靈敏、高效的病原檢測技術(shù)加強(qiáng)對蝦苗種或養(yǎng)殖期特定病原的定期檢測被認(rèn)為是防控對蝦病害流行的有效手段。等溫擴(kuò)增技術(shù)作為一種新興的檢測手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)、動

2、物衛(wèi)生等相關(guān)病原檢測中。為了加強(qiáng)兩種重要對蝦病害——對蝦白斑?。╓hite spot disease，WSD）和黃頭?。╕ellow head disease，YHD）的防控，本研究分別建立了對蝦白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、黃頭病毒（Yellow head virus，YHV）的快速、高靈敏等溫擴(kuò)增檢測技術(shù)。
　　本研究根據(jù)對蝦WSSV基因組的保守序列設(shè)計合成5條特異性引物，通過

3、對反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs等試劑組分和溫度、時間等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了WSSV的交叉引物等溫擴(kuò)增（cross priming amplification，CPA）檢測方法，并將該檢測方法與WSSV的套式PCR、qPCR以及LAMP檢測方法進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，該CPA方法的最佳反應(yīng)溫度為63℃，反應(yīng)時間為60min；對WSSV的最低檢測限為10 copies/μL，靈敏度高于套式PCR檢測方法的最低檢測限100 copies

4、/μL，并與qPCR以及LAMP有著相同的靈敏度。WSSV CPA檢測方法與WSSV、IHHNV、HPV、TSV、YHV以及副溶血弧菌沒有交叉反應(yīng)。WSSV的CPA檢測方法比PCR更為簡便、快速、靈敏，且無需昂貴的變溫儀器，非常適于養(yǎng)殖對蝦病原的現(xiàn)場檢測，本研究為對蝦苗種、養(yǎng)殖期WSSV的靈敏、特異和快速檢測提供了新的方法。
　　本文還針對國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的黃頭病毒的一種新株型YHV中國株（YHV-7）和YHV泰國株(YHV-1)，建立了

5、一種通用型一步式實(shí)時熒光定量反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法（rRT-LAMP）。首先根據(jù)YHV中國株和YHV泰國株的共同保守序列，利用Primer Explorer V3軟件設(shè)計了6條引物，并對rRT-LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)溫度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時制備RNA標(biāo)準(zhǔn)品并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，將建立的rRT-LAMP檢測方法與rRT-PCR進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明：58℃保溫、Mg2+終濃度8mmol/L、dNTPs終濃度1.4 mmol/L是YHV的最

6、適rRT-LAMP反應(yīng)條件。該方法的檢測靈敏度為100 copies/μL，而本研究建立的YHV rRT-PCR的靈敏度為100 copies/μL，YHV rRT-LAMP檢測方法比rRT-PCR檢測方法的靈敏度高出100倍，該檢測方法與TSV、WSSV、IHHNV、HPV、對蝦組織RNA以及溶藻弧菌沒有交叉反應(yīng)。本試驗(yàn)所建立的檢測黃頭病毒的rRT-LAMP方法，為該病毒的致病機(jī)制研究、臨床早期診斷及定量分析該株型黃頭病毒的感染程度奠

7、定了基礎(chǔ)。同時，本研究進(jìn)行了YHV RT-LAMP快速檢測試劑盒的嘗試，YHV RT-LAMP快速檢測試劑盒與YHV rRT-LAMP檢測方法具有相同的靈敏度。這種試劑盒的應(yīng)用，不僅可以快速、有效的檢測YHV中國株和YHV泰國株，同時，也將大大降低污染的可能性，減少假陽性的產(chǎn)生，非常適用于對蝦養(yǎng)殖YHV的現(xiàn)場快速檢測，具有較高的臨床應(yīng)用價值。
　　本論文最后以建立好的WSSV qCPA檢測方法和YHV rRT-LAMP檢測方法對W