環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)孕婦血清中巨細(xì)胞病毒方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、人類巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)是引起孕婦活動(dòng)性感染及胎兒宮內(nèi)感染最常見、也是危害最大的病毒之一。它可在感染孕婦后經(jīng)胎盤或上行性感染傳播給胎兒，導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、畸形及出生后多器官功能障礙等嚴(yán)重后果。傳統(tǒng)ELISA法的敏感性和特異性均不能滿足臨床要求，而熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)也存在著對(duì)技術(shù)設(shè)備要求高，檢測(cè)成本昂貴等缺點(diǎn)。本研究目的在于建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的低成本檢測(cè)孕婦血清中HCMV

2、 DNA的方法并初步評(píng)價(jià)該技術(shù)在臨床應(yīng)用價(jià)值。 我們采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(100p-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)建立了快速檢測(cè)孕婦血清中的HCMV DNA的反應(yīng)體系。該方法在HCMV的IE1基因區(qū)段設(shè)計(jì)了二對(duì)特異性引物，在Bst DNA聚合酶作用下60℃恒溫反應(yīng)60分鐘即可完成對(duì)HCMV DNA擴(kuò)增過程。擴(kuò)增產(chǎn)物以2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 為確立了最佳反應(yīng)條件我們對(duì)

3、LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)表明溫度是LAMP的最大影響因素，而鎂離子和甜菜堿濃度對(duì)反應(yīng)影響不大。為評(píng)價(jià)該技術(shù)的特異性，我們使用設(shè)計(jì)的特異HCMV引物同時(shí)對(duì)HCMV、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型及人類基因組DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。僅HCMV DNA擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳后出現(xiàn)特異的梯狀條帶，進(jìn)一步對(duì)該擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果也與預(yù)期相符。這表明LAMP技術(shù)對(duì)孕婦血清中HCMV DNA的擴(kuò)增是特異的。我們對(duì)原始模板進(jìn)行梯度稀釋來測(cè)試其敏感性，

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LAMP技術(shù)可以穩(wěn)定檢出HCMVDNA的下限為102拷貝/ml。 應(yīng)用LAMP方法對(duì)126例孕婦血清進(jìn)行HCMV DNA檢測(cè)并將結(jié)果與ELISA和FQ-PCR法相比較。結(jié)果顯示在126例樣本中，LAMP法、ELISA和FQ-PCR三種方法分別檢出的42例、14例及44例。ELISA法與FQ-PCR陽性符合率31.8％，兩種方法存在顯著性差異(P<0 01)；LAMP法與FQ-PCR陽性符合率95.4％，差異不顯著(P