環(huán)介導等溫擴增檢測孕婦血清中巨細胞病毒方法的建立及初步應用.pdf

1、人類巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)是引起孕婦活動性感染及胎兒宮內(nèi)感染最常見、也是危害最大的病毒之一。它可在感染孕婦后經(jīng)胎盤或上行性感染傳播給胎兒，導致流產(chǎn)、死胎、畸形及出生后多器官功能障礙等嚴重后果。傳統(tǒng)ELISA法的敏感性和特異性均不能滿足臨床要求，而熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)也存在著對技術(shù)設備要求高，檢測成本昂貴等缺點。本研究目的在于建立一種靈敏度高、特異性強的低成本檢測孕婦血清中HCMV

2、 DNA的方法并初步評價該技術(shù)在臨床應用價值。 我們采用環(huán)介導等溫擴增(100p-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)建立了快速檢測孕婦血清中的HCMV DNA的反應體系。該方法在HCMV的IE1基因區(qū)段設計了二對特異性引物，在Bst DNA聚合酶作用下60℃恒溫反應60分鐘即可完成對HCMV DNA擴增過程。擴增產(chǎn)物以2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。 為確立了最佳反應條件我們對

3、LAMP反應體系進行了優(yōu)化。實驗表明溫度是LAMP的最大影響因素，而鎂離子和甜菜堿濃度對反應影響不大。為評價該技術(shù)的特異性，我們使用設計的特異HCMV引物同時對HCMV、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型及人類基因組DNA進行LAMP擴增。僅HCMV DNA擴增產(chǎn)物在電泳后出現(xiàn)特異的梯狀條帶，進一步對該擴增產(chǎn)物的酶切結(jié)果也與預期相符。這表明LAMP技術(shù)對孕婦血清中HCMV DNA的擴增是特異的。我們對原始模板進行梯度稀釋來測試其敏感性，

4、實驗結(jié)果表明LAMP技術(shù)可以穩(wěn)定檢出HCMVDNA的下限為102拷貝/ml。 應用LAMP方法對126例孕婦血清進行HCMV DNA檢測并將結(jié)果與ELISA和FQ-PCR法相比較。結(jié)果顯示在126例樣本中，LAMP法、ELISA和FQ-PCR三種方法分別檢出的42例、14例及44例。ELISA法與FQ-PCR陽性符合率31.8％，兩種方法存在顯著性差異(P<0 01)；LAMP法與FQ-PCR陽性符合率95.4％，差異不顯著(P