結核桿菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法及間接ELISA檢測方法的研究.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌引起的一種慢性人畜共患病。據(jù)估計，全球約有1/3的人口被結核感染，準確、及時地對結核患者進行診斷是治療和控制結核所必需的。結核菌素實驗是臨床診斷結核常用的方法，也是國際動物衛(wèi)生組織與我國認可的法定檢疫方法。但由于結核菌素可能包含有與其它分枝桿菌相同的抗原組份,檢測時容易出現(xiàn)假陽性,并且此檢測不能區(qū)分自然感染者與卡介苗免疫者。此外還有很多結核病的診斷方法如細菌培養(yǎng)、痰檢、PCR、IFN-Y診斷法等,但這些方法的缺點是

2、檢測時間長,操作煩瑣,需要昂貴的儀器設備,而且要有專門的人進行操作等,因此不利于結核病的檢測?；谝陨显?，本實驗研究了兩種新型的結核檢測方法：
　　 一、建立一種快速、高敏感、高特異、鑒別結核分枝桿菌和牛分枝桿菌的方法。實驗根據(jù)大多數(shù)致病性結核分枝桿菌共有序列esat-6,結核分枝桿菌和牛分枝桿菌gyrB共有特異性序列，以及結核分枝桿菌種特異序列mtp40設計6對特異性引物對痰液中的結核分枝桿菌進行檢測，并與鑒別培養(yǎng)基分離培養(yǎng)

3、結果以及常規(guī)PCR鑒定結果進行比較。實驗結果表明，建立的LAMP檢測方法具有很高的特異性?？蓞^(qū)分致病性結核分枝桿菌和非致病結核分枝桿菌，也可鑒別結核分枝桿菌和牛分枝桿菌。LAMP檢測技術的靈敏度比經典PCR技術高100倍左右，可檢測到7拷貝/反應。另外,用三種方法檢測樣品發(fā)現(xiàn)，LAMP與細菌培養(yǎng)的符合率為90.91％，LAMP與常規(guī)PCR檢測結果的符合率為100％。該檢測方法可以在流行病學調查及現(xiàn)場快速診斷方面廣泛應用,并為臨床治療提供

4、依據(jù)。
　　 二、采用多抗原組合的方法建立一種特異性高，靈敏度好的結核血清學診斷方法。利用分子生物學方法克隆、表達抗原蛋白ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c，并用蛋白純化試劑盒進行純化。將四種蛋白ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c按1：1：1：1組合，作為診斷抗原來檢測血清中的結核抗體。最終以ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c作為診斷抗原建立了間接ELISA方法,并確定了ELISA診斷方

5、法的判定標準,即S/P≥0.235為陽性,S/P<0.202為陰性,0.235>S/P≥0.202為可疑。ELISA方法的特異性為95.8.％、敏感性為65.0％。對20份痰檢陽性和120份健康人血清樣品進行了檢測,并與痰檢結果比較。20份痰檢陽性血清樣品中有13份為ELISA檢測陽性,陽性符合率為65.0％,120份健康人血清，5份為陽性，其余為陰性，陰性符合率為95.8％,本ELISA方法與痰檢診斷方法總符合率為91.4％。研究表明