多西環(huán)素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、多西環(huán)素(Doxycycline，DOX)是一種常用獸用抗生素，是動(dòng)物源性食品中最常見的獸藥殘留之一，當(dāng)不遵守休藥期或不按規(guī)范添加用藥時(shí)，DOX就會(huì)殘留在動(dòng)物組織及其副產(chǎn)品中（包括蛋、奶）。殘存于動(dòng)物產(chǎn)品中的DOX及其代謝產(chǎn)物會(huì)嚴(yán)重威脅人類健康。
　　 在國(guó)內(nèi)及國(guó)外已經(jīng)建立起了多種檢測(cè)DOX藥物殘留的儀器檢測(cè)方法，雖然其中有些方法在靈敏度、精確度上都比較令人滿意，但由于操作步驟繁瑣（復(fù)雜的樣品處理過程等）、消耗時(shí)間多、費(fèi)用較高、

2、對(duì)操作人員技術(shù)要求全面等原因而不適合基層及大批量樣品的檢測(cè)。免疫學(xué)檢測(cè)方法以其較高的敏感性、特異性，和簡(jiǎn)便性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域。本研究旨在建立動(dòng)物性產(chǎn)品中DOX殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫(ic-ELISA)檢測(cè)方法，為進(jìn)一步試劑盒的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：
　　 1.多西環(huán)素抗體的制備與鑒定。
　　 通過人工合成抗原，免疫3-4月齡雄性新西蘭大白兔，產(chǎn)生了針對(duì)DOX的特異性抗體，經(jīng)間接ELISA

3、檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)最高達(dá)1:80,000。并采用辛酸-硫酸銨法及G200過濾純化。
　　 2.多西環(huán)素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA條件的優(yōu)化。
　　 采用間接及間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法確定了抗原、抗體工作濃度分別為0.5μg/mL和1:32,000的抗體稀釋倍數(shù)，最佳包被條件為4℃下過夜，最佳抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為15min。
　　 3.多西環(huán)素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立。
　　 采用ic-ELISA方法，建立

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到DOX的半數(shù)抑制(IC50)值為8.74μg/L,檢測(cè)限為1.96μg/L。該方法檢測(cè)范圍為1.96-160μg/L。批內(nèi)平均變異系數(shù)在肝臟和肌肉樣品中分別為5.75％和7.53％；批間平均變異系數(shù)在肝臟和肌肉樣品中分別為5.92％和7.21％。交叉反應(yīng)試驗(yàn)表明除土霉素有10.71％的交叉反應(yīng)外，其他類似結(jié)構(gòu)交叉反應(yīng)均較弱。這些結(jié)果表明采用ic-ELISA檢測(cè)多西環(huán)素的方法是可行的。
　　 4.樣品添加回收試驗(yàn)。<