豬2型鏈球菌間接ELISA和間接血凝抗體檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、本課題的研究目的： 1.建立以豬2型鏈球菌莢膜多糖為抗原的間接ELISA檢測(cè)方法。 2.構(gòu)建溶血素基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，并分析表達(dá)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性，建立以溶血素為靶蛋白的豬鏈球菌間接血凝(IHA)抗體檢測(cè)方法。 3.以上述兩種方法對(duì)臨床上送檢血清進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證建立的兩方法的符合率，并分析最近一年內(nèi)我國(guó)豬2型鏈球菌的流行病學(xué)特點(diǎn)。 豬2型鏈球菌能產(chǎn)生多種毒力因子，常見(jiàn)的有莢膜多糖(CPS)、溶菌酶釋放蛋白(M

2、uramidase-released protein，MRP)、胞外因子(Extracellular factor,EF)，溶血素(Suilysin，SLY)等，其中CPS是最早被證實(shí)的豬2型鏈球菌毒力因子，也是進(jìn)行分型的依據(jù)，采用改良的kodana方法提取豬2型鏈球菌的莢膜多糖，并以此作為抗原建立間接ELISA抗體檢測(cè)方法，對(duì)各方面條件進(jìn)行優(yōu)化，研制出豬2型鏈球菌間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒。另外發(fā)病豬的豬2型鏈球菌中有相當(dāng)高比例的菌

3、株表現(xiàn)出溶血素活性，因而豬2型鏈球菌溶血素被認(rèn)為是該菌主要的毒力因子。根據(jù)豬2型鏈球菌溶血素基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，采用PCR擴(kuò)增豬2型鏈球菌LT-1分離株溶血素基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T質(zhì)粒載體中，酶切和PCR鑒定后測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示，擴(kuò)增的LT-1株溶血素基因長(zhǎng)度為1494bp，編碼497個(gè)氨基酸。將溶血素基因克隆入表達(dá)載體pET-28a中，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定，篩選陽(yáng)性克隆，用SDS-PAGE電泳和Wes

4、tern blot進(jìn)行溶血素的表達(dá)和鑒定。結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物具有免疫反應(yīng)性。然后以表達(dá)的溶血素蛋白為抗原致敏綿羊紅細(xì)胞，并對(duì)各方面條件優(yōu)化，建立豬鏈球菌間接血凝試驗(yàn)(IHA)。 采用間接ELISA方法檢測(cè)從河南、安徽、江西、湖南、湖北、福建、廣東、廣西和北京等地送檢的血清樣品共3991份，結(jié)果表明陽(yáng)性率分別為33.75％，41.6％等，各省血清樣品陽(yáng)性率從0％到41.6％。本研究建立的兩種檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、敏感性高并適用