牛結(jié)核病特異抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文牛結(jié)核病特異抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用姓名：張桂榮申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：陳煥春;譚亞娣20060601牛結(jié)核病特異抗體問(wèn)接E L I S A 檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用摘要牛結(jié)核病主要是由牛分枝桿菌( M y c o b a c t e r i u mb o v i s ) 弓l 起的一種人獸共患傳染病。該病呈慢性經(jīng)過(guò)，主要經(jīng)呼吸道和經(jīng)口感染。排菌的重癥病牛是本病的主要傳染源。

2、該病在世界各國(guó)都有發(fā)生，尤其是近年來(lái)，隨著結(jié)核菌耐藥菌株的產(chǎn)生及個(gè)體養(yǎng)牛戶的增加，牛結(jié)核病的疫情呈逐年上升趨勢(shì)。該病的傳播流行給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，至今牛結(jié)核病所造成的損失大于牛的其他各種疾病所造成損失的總和。同時(shí)由于牛結(jié)核病也可傳染給人，從而給人類公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重隱患，因此采取一切措施防治牛結(jié)核病刻不容緩。由于目前牛結(jié)核病沒(méi)有有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防，許多國(guó)家主要采用不免疫，加強(qiáng)檢疫，陽(yáng)性牛一律撲殺的原則來(lái)實(shí)現(xiàn)牛結(jié)核病的控制

3、。因此準(zhǔn)確而及時(shí)的診斷方法對(duì)于該病的防治顯得尤為重要。目前對(duì)于牛結(jié)核病的檢測(cè)，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織( O f f i c e I n t e r n a t i o n a l D e sE p i z o o t i e s ，0 I E ) 唯一推薦的方法是牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)( T u b e r c u l i n s k i nt e s t ，T S T ) ，但該方法存在嚴(yán)重的非特異性反應(yīng)及對(duì)重癥牛的低反應(yīng)力。結(jié)核菌素純化

4、蛋白衍化物( P r o t e i np u r i f i e dd e r i v a t i v e 。P P D ) 用于間接酶聯(lián)免疫吸附方法( E n z y m e ．1 i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y s ，E L I S A ) 檢測(cè)結(jié)核抗體也被嘗試過(guò)，但由于P P D 是一種成分復(fù)雜的蛋白混合物，除了含有牛分技桿菌特異性分泌抗原外，還含有許多其他分枝桿菌具有的

5、類屬抗原，因此交叉反應(yīng)無(wú)法避免，而且早期感染牛多數(shù)抗體水平較低。鑒于以上情況，探索一種特異、敏感的檢疫方法是控制牛結(jié)核病的當(dāng)務(wù)之急。M P B 7 0 、M P B 8 3 、C F P I O 和E s A l ：6 是牛分枝桿菌特異性抗原，許多研究已經(jīng)證實(shí)是非常有前景的鑒別診斷候選抗原。本研究采用這四種抗原建立了檢測(cè)牛結(jié)核病的間接E L I S A 方法，旨在為臨床結(jié)核病的診斷提供一種特異性，敏感性和實(shí)用性都比較理想的診斷試劑，為我

6、國(guó)牛結(jié)核病的防控提供技術(shù)支持。主要研究?jī)?nèi)容包括：1 ．P P D ．E L I S A 方法的優(yōu)化本研究在前人工作的基礎(chǔ)上對(duì)P P D ．E L I S A 的封閉液，血清稀釋液，酶標(biāo)二抗稀釋液，底物作用時(shí)間，終止液的選擇及陰陽(yáng)判定等方面作了改進(jìn)。改進(jìn)后的E L I S A陰性背景降低，血清稀釋液簡(jiǎn)化，酶標(biāo)二抗利用效率提高，結(jié)果判定更加科學(xué)。2 ．E L I S A 檢測(cè)牛奶中結(jié)核病抗體的探討保存期試驗(yàn)顯示，牛奶樣品在4 “ C 放7

7、d ，- 2 0 ℃存放1 5 d 以上不影響E L I S A 檢測(cè)結(jié)果．但牛奶反復(fù)凍融對(duì)抗體效價(jià)影響很大。E L I S A 檢測(cè)牛奶與檢測(cè)血清比較，兩者有9 0 ．8 ％的符合。3 ．牛結(jié)核特異性抗體E L I S A 檢測(cè)方法的建立借鑒優(yōu)化后的P P D ．E L I S A 程序，分別建立了C F P I O ．E S A l b E L I s A 、M P B 7 0 ．E L I S A 和M P B 8 3 ．E L