基于小反芻獸疫病毒疫苗株N蛋白的抗體檢測間接ELISA方法的建立及初步應用.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種嚴重危害小反芻動物的急性、熱性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將PPR列為需要通報的動物傳染病，危害性極大，發(fā)病動物死亡率為100％，并且目前對于該病沒有切實可靠的治療措施，因此對于PPR的防控至關(guān)重要。對本病的的防控最常用和經(jīng)濟的方法是疫苗免疫接種，對免疫

2、效果檢測常通過檢測免疫抗體水平來評價，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是監(jiān)測抗體水平簡單有效的方法，但目前國內(nèi)市場用于有效檢測PPRV抗體水平的試劑盒還是比較缺乏，并且大多數(shù)為進口試劑盒，雖然檢測效果較為可靠，但其成本高，限制了其在防控PPR中的應用，需要研發(fā)PPR抗體檢測試劑盒，用于臨床檢測。N蛋白為PPRV的核衣殼蛋白，其生物學功能多、保守性強，是PPRV中特異性最高、含量最豐富以及免疫原性最強的結(jié)構(gòu)蛋白，是研制PPR抗體檢測試劑盒的

3、首選蛋白。
　　本研究從PPR疫苗毒中克隆獲得PPRV N蛋白全基因，原核表達和鑒定后，收集目的蛋白并進行復性。以復性后的N蛋白作為包被抗原，建立檢測PPR免疫抗體的間接ELISA方法并進行初步應用。研究獲以下結(jié)果:
　　1.PPRV疫苗株N蛋白的基因克隆和原核表達:從PPR疫苗毒中通過RT-PCR克隆N基因全序列，基因長度為1578bp，將目的基因連接至pET-28a載體，構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pET-28a-N。將重組質(zhì)粒

4、轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，篩選獲得重組表達菌pET-28a-N/BL21。誘導表達的最佳條件為:IPTG1.0mmol/L，誘導7h。表達的蛋白主要以包涵體形式存在，蛋白的大小約為58ku。Western-blot檢測表明，復性后的N蛋白具有良好的特異性和反應性。
　　2.PPR抗體檢測間接ELISA方法的建立和初步應用:以純化復性后N蛋白為包被抗原，建立檢測PPRV抗體的間接ELISA方法。抗原每孔包被400ng，陽性血清和待檢血