基于小反芻獸疫病毒疫苗株N蛋白的抗體檢測(cè)間接ELISA方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種嚴(yán)重危害小反芻動(dòng)物的急性、熱性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將PPR列為需要通報(bào)的動(dòng)物傳染病，危害性極大，發(fā)病動(dòng)物死亡率為100％，并且目前對(duì)于該病沒有切實(shí)可靠的治療措施，因此對(duì)于PPR的防控至關(guān)重要。對(duì)本病的的防控最常用和經(jīng)濟(jì)的方法是疫苗免疫接種，對(duì)免疫

2、效果檢測(cè)常通過檢測(cè)免疫抗體水平來評(píng)價(jià)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是監(jiān)測(cè)抗體水平簡(jiǎn)單有效的方法，但目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)用于有效檢測(cè)PPRV抗體水平的試劑盒還是比較缺乏，并且大多數(shù)為進(jìn)口試劑盒，雖然檢測(cè)效果較為可靠，但其成本高，限制了其在防控PPR中的應(yīng)用，需要研發(fā)PPR抗體檢測(cè)試劑盒，用于臨床檢測(cè)。N蛋白為PPRV的核衣殼蛋白，其生物學(xué)功能多、保守性強(qiáng)，是PPRV中特異性最高、含量最豐富以及免疫原性最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白，是研制PPR抗體檢測(cè)試劑盒的

3、首選蛋白。
　　本研究從PPR疫苗毒中克隆獲得PPRV N蛋白全基因，原核表達(dá)和鑒定后，收集目的蛋白并進(jìn)行復(fù)性。以復(fù)性后的N蛋白作為包被抗原，建立檢測(cè)PPR免疫抗體的間接ELISA方法并進(jìn)行初步應(yīng)用。研究獲以下結(jié)果:
　　1.PPRV疫苗株N蛋白的基因克隆和原核表達(dá):從PPR疫苗毒中通過RT-PCR克隆N基因全序列，基因長(zhǎng)度為1578bp，將目的基因連接至pET-28a載體，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-N。將重組質(zhì)粒

4、轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，篩選獲得重組表達(dá)菌pET-28a-N/BL21。誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件為:IPTG1.0mmol/L，誘導(dǎo)7h。表達(dá)的蛋白主要以包涵體形式存在，蛋白的大小約為58ku。Western-blot檢測(cè)表明，復(fù)性后的N蛋白具有良好的特異性和反應(yīng)性。
　　2.PPR抗體檢測(cè)間接ELISA方法的建立和初步應(yīng)用:以純化復(fù)性后N蛋白為包被抗原，建立檢測(cè)PPRV抗體的間接ELISA方法?？乖靠装?00ng，陽性血清和待檢血