小反芻獸疫及水泡性口炎病毒N蛋白表達(dá)及應(yīng)用.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petitsruminants virus，PPRV)引起的以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為主要特征的一種急性傳染病，PPRV基因組為有囊膜的多形性單股無節(jié)段負(fù)鏈RNA，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(N、M、P、L、F和H蛋白)，其中N蛋白是PRRV核衣殼蛋白，也是主要結(jié)構(gòu)蛋白，是PPRV抗原性最穩(wěn)定、含量最高的蛋白，動(dòng)物感染PPRV后可迅速

2、產(chǎn)生針對(duì)N蛋白的高滴度抗體，雖然該抗體不具有中和病毒的活性，但抗體維持時(shí)間較長(zhǎng)。水泡性口炎(VesicularStomatitis，VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)引起多種動(dòng)物感染易感的以舌、唇、口腔黏膜、乳頭和蹄冠等處上皮發(fā)生水泡樣病變?yōu)橹饕卣鞯囊环N急性、高度接觸性傳染病，VSV基因組為線狀單股負(fù)鏈RNA，從3'到5'端依次編碼了N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白，其中其中

3、N蛋白能保護(hù)病毒免受核糖核酸酶的降解，在病毒的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程中起著很關(guān)鍵的作用，且N蛋白具有高度保守性，VSV所有型之間均具有交叉保護(hù)性。鑒于此，本研究對(duì)PPRV和VSV N蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行了應(yīng)用，即利用純化后的PPRV N蛋白建立了PPRV間接ELISA抗體檢測(cè)方法;利用純化后的VSV N蛋白制備了VSV單克隆抗體。旨在為PPRV的臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、疫苗免疫效果監(jiān)測(cè)等提供一種簡(jiǎn)單、快速、敏感、特異的血清學(xué)診

4、斷方法;為VSV發(fā)病機(jī)理研究和VSV抗原診斷試劑的研制奠定基礎(chǔ)。
　　參照GenBank中已發(fā)表的PPRV基因組N基因序列，設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增了長(zhǎng)約1500 bp的N基因片段，將目的片段亞克隆至pColdⅠ原核表達(dá)載體中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組N蛋白的表達(dá)，重組蛋白經(jīng)親和層析法純化后，Western-Blotting檢測(cè)證明具有重組蛋白良好的免疫原性。以重組N蛋白為包被抗原，經(jīng)間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了

5、檢測(cè)PPRV抗體的間接ELISA診斷方法，該方法檢測(cè)口蹄疫病毒、羊痘病毒、偽狂犬病毒陽(yáng)性血清均為陰性;該方法重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于10％;該方法與進(jìn)口小反芻獸疫血清抗體檢測(cè)試劑盒的符合率為達(dá)98.3％。
　　參照GenBank中已發(fā)表的VSV基因組N基因序列，分別合成VSV不同血清型的N基因，經(jīng)序列對(duì)比分析后，設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增了長(zhǎng)約1200 bp的N基因片段，將目的片段亞克隆至pColdⅠ原核表達(dá)載體中，經(jīng)IP

6、TG誘導(dǎo)重組N蛋白的表達(dá)，重組蛋白經(jīng)親和層析法純化后，Western-Blotting檢測(cè)證明具有重組蛋白良好的反應(yīng)性。以重組N蛋白為免疫原免疫6周齡BALB/c雌鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，經(jīng)間接ELISA篩選獲得了3株穩(wěn)定分泌VSV特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，間接免疫熒光試驗(yàn)表明3株單克隆抗體均可與VSV發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　綜上，本研究利用原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)的PPRVN蛋白具有良好反應(yīng)活性，以純化的重組N蛋白為