水皰性口炎病毒N基因的克隆及在原核中的高效表達.pdf

1、該論文由兩部分構(gòu)成,一是利用RT-PCR技術(shù)克隆出水皰性口炎病毒(VSV)的N基因,二是利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng),通過基因重組技術(shù)高效表達出N基因.主要實驗和結(jié)果如下:1.以VSV雞胚呈纖維細胞毒為材料,參照已發(fā)表的VSV基因組序列,設(shè)計1對引物,采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴增出VSV N基因,將之連接于克隆載體pGEM-T載體后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a,經(jīng)37℃過夜培養(yǎng),挑取陽性克隆,將PCR和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測序,比較

2、測序株,IND wild株,tsG31株,HR株相應(yīng)核苷酸序列和氨基酸序列同源性,其核苷酸同源性高達99%;氨基酸同源高達99%,進一步證實了VSV N基因的高度保守性.2.設(shè)計一對分別帶有EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點的表達引物,從以上實驗構(gòu)建的重組質(zhì)粒中擴增出VSV的N基因,分別與克隆載體pGEM-T Vector連接并轉(zhuǎn)化,陽性克隆擴增后提取重組質(zhì)粒pGEM-T-N1.EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切pGEM-T-N1以及表達載體

3、pET-30c(+),以產(chǎn)生粘性末端.純化回收后,將之與pET-30c(+)連接,并分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),獲得重組質(zhì)粒pETVSV-N.PCR、酶切和序列分析鑒定目的基因的插入位置、方向和讀碼框完全正確,1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)得到分子量為53 kDa的目的蛋白,Western blot檢測表明,表達的目的蛋白能被VSV陽性血清所識別,從而為建立用重組N蛋白作為診斷抗原的ELISA方法及其它血清學(xué)方法奠定了基礎(chǔ).