豬源殺菌通透性增加蛋白N端基因的克隆原核表達及抗菌活性測定.pdf

1、隨著當代社會出現(xiàn)了大量抗生素的濫用，藥物殘留現(xiàn)象已經(jīng)變得越來越嚴重。殺菌通透性增加蛋白(BPI)以其作為一種具有天然的防御功能的一種新型物質(zhì)出現(xiàn)。其特點是具有廣譜的抗菌、抗腫瘤、抗寄生蟲等方面的生物學(xué)特性。并且具有細菌不容易產(chǎn)生耐藥性的特點而被人們寄希望于在未來能夠取代抗生素，作為一種新型藥物出現(xiàn)。
　　豬源殺菌通透性增加蛋白(BPI)作為一種來自于豬中性粒細胞中分離得到的一種抗菌活性物質(zhì)。其中，起主要殺菌作用的為豬源殺菌通透性增

2、加蛋白(BPI)N端基因，一般由200～240個氨基酸組成。大多數(shù)的革蘭陰性菌對BPI-N端蛋白非常的敏感，并且，BPI-N蛋白對少部分的革蘭陽性菌也具有一定的抗菌活性。本實驗通過利用基因工程技術(shù)對BPI-N端基因進行克隆表達以及抗菌活性的研究。為以后豬源殺菌通透性增加(BPI)N端蛋白的實際生產(chǎn)以及應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ)。
　　1、BPI-N端基因的擴增
　　根據(jù)NCBI上已發(fā)表的豬源殺菌通透性增加蛋白(BPI)基因序列，利

3、用軟件，分析得出了豬源殺菌通透性增加蛋白(BPI)N端基因序列。再利用DNAstar、Primer5以及Oligo等軟件，設(shè)計了兩條豬源殺菌通透性增加蛋白(BPI)N端基因的擴增引物P1、P2，并加入腸激酶切割位點，為后期腸激酶作用提供靶向引導(dǎo)，以防表達產(chǎn)物被組氨酸標簽包裹而不具有抗菌活性。從豬的肝臟中抽提RNA，進行擴增。將其插入pMD19-T載體上進行測序。所獲序列與已發(fā)表的豬源殺菌通透性增加蛋白(BPI)N端基因序列(GenBan

4、k ID:NM_001159307.1)完全相同。
　　2、BPI-N端基因在大腸桿菌中的克隆、表達
　　通過利用Primer5分析軟件選取了Bam HⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點。利用BamHⅠ和XhoⅠ分別將含有BPI-N的目的基因重組質(zhì)粒pMD19-T-BPI-N和表達載體pET-32a進行雙酶切后，回收、純化。連接構(gòu)建成原核表達質(zhì)粒，將其命名為pET-32a-BPI-N。將重組質(zhì)粒pET-32a-BPI-N轉(zhuǎn)化入DH5α

5、中進行篩選，同時進行PCR和單雙酶切鑒定，鑒定成功后，提取重組質(zhì)粒pET-32a-BPI-N。將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG(濃度大約1.5M)誘導(dǎo)。使其表達BPI-N蛋白。通過SDS-PAGE鑒定以及對表達條件的優(yōu)化，表明pET-32a-BPI-N已經(jīng)在大腸桿菌中獲得了高效的表達，SDS-PAGE結(jié)果顯示表達產(chǎn)物的分子量大約為47.0KD。在上清中表達含量較高。為了測定BPI-N蛋白的活性。將BPI-N蛋白進行鎳離

6、子柱親和層析。從而得到純度較高的融合蛋白。經(jīng)過腸激酶切割，去掉組氨酸標簽后，獲得分子量大約26.0KD左右的BPI-N端蛋白。
　　3、豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)進行抗菌活性研究
　　將經(jīng)過純化切割以后的豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)進行抗菌活性以及其穩(wěn)定性的研究。結(jié)果表明:豬源殺菌/通透性增加蛋白N端(BPI-N)對實驗的革蘭陰性菌都具有抗菌活性。對少數(shù)的革蘭陽性菌也具有抗菌活性。紫外光照射對豬