融合蛋白Append的原核表達及活性測定.pdf

1、細胞的無限制增長和腫瘤血管的形成是腫瘤生長過程中的兩個關鍵因素，如果抗腫瘤藥物能夠同時瞄準一個以上的目標，采取“多個靶點”方式攻擊癌細胞，就可能獲得更好的臨床效果。 凋亡素(apoptin)是一種來源于雞貧血病病毒(chicken anemia virus,CAV)的小蛋白質(zhì)(VP3)，由121個氨基酸組成，分子量為13.6kDa，它能夠特異性地誘導人轉化細胞和腫瘤細胞的凋亡。一系列的研究結果已證實apoptin作為一種抗腫瘤制

2、劑是安全有效的。 血管內(nèi)皮抑素(endostatin)是近年來發(fā)現(xiàn)的最有效血管生成抑制因子之一。Endostatin為膠原蛋白ⅩⅧ的C末端片段，編碼184個氨基酸，分子量為20kDa。 在本研究中，構建了一種新的融合基因，命名為Append，其表達產(chǎn)物的結構為以柔性多肽-甘氨酸接頭(Gly<,4>Ser)<,3>將apoptin與endostatin連接起來的融合蛋白；之后利用原核表達系統(tǒng)表達該融合蛋白并對其生物功能進行

3、評價。 本研究針對內(nèi)皮抑素cDNA序列設計引物，用反轉錄聚合酶鏈反應從人胎肝總RNA中釣取內(nèi)皮抑素cDNA；根據(jù)apoptin基因序列設計引物，用聚合酶鏈反應從質(zhì)粒pUC-Apoptin中擴增凋亡素基因；采用重疊引物延伸法，使凋亡素基因和內(nèi)皮抑素基因通過一個(Oly<,4>Ser)<,3>的連接肽基因相連接，構成融合基因Append；將融合基因Append克隆入pOEM-T easy載體中，通過酶切、PcR及序列測定；將測序正確

4、的Append融合基因分別克隆進3種原核表達載體pLLP-OmpA、pET-His和pET-DsbA中，并將鑒定正確的原核表達載體分別命名為：pLLP-OmpA-Append、pET-His-Append和pET-DsbA-Append；之后優(yōu)化原核表達條件；采用鎳瓊脂糖親和層析法對表達的蛋白進行純化；純化的蛋白進行SDS-PAGE及Western Blot檢測，并進行活性測定。 實驗結果表明，采用重疊引物延伸法獲得了融合基因A

5、ppend，全長為960bp，與預期相符；共構建了3個重組原核表達質(zhì)粒，經(jīng)過優(yōu)化原核表達條件確定pLLP-OmpA-Append最適于表達Append融合蛋白，可溶性蛋白的表達量為1.43mg/L，純度為91.7％。純化的Append融合蛋白進行SDS-PAGE，獲得的目的蛋白大小與預期相符，約為33.6kDa，Western blot鑒定結果為陽性；活性測定結果表明Append融合蛋白在體外可以抑制臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖并可誘導人神經(jīng)膠