人親環(huán)素D的重組表達(dá)及融合蛋白的活性測(cè)定.pdf

1、目的:為了研究以親環(huán)素D(cyclophilinD,CypD)蛋白為作用靶點(diǎn)來進(jìn)行藥物篩選,從而找到一種藥物高通量篩選的方法,本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/CypD,體外提取純化融合蛋白GST-CypD,并測(cè)定其氨基脯氨酸順反異構(gòu)酶(peptidyl-prolylcis-transisomerases,PPIase)活性。
　　 方法:采用RT-PCR.法從7721細(xì)胞中擴(kuò)增CypD基因的全長cDNA,將純化后

2、的cDNA與pMD18-T Simple Vector直接連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109,經(jīng)藍(lán)白斑篩選,挑選白色克隆擴(kuò)增、鑒定為重組質(zhì)粒pMD18-T/CypD。pMD18-T/CypD和pGEX-4T-1分別用EcoR I、Sal I雙酶切,低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收所需片段,將兩者連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,提取重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/CypD,進(jìn)行酶切及核苷酸序列測(cè)序鑒定。將陽性克隆擴(kuò)增并優(yōu)化表達(dá)條件,采用親和層析方法提取純化融

3、合蛋白GST-CypD。利用糜蛋白酶偶聯(lián)法來測(cè)定融合蛋白中CypD的氨基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性。
　　 結(jié)果:擴(kuò)增出CypD的全長cDNA編碼區(qū),并重組到原核表達(dá)質(zhì)粒載體pGEX-4T-1中,重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/CypD轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后,經(jīng)異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)出相對(duì)分子質(zhì)量為66KD的融合蛋白,活性測(cè)定表明融合蛋白GST-CypD具有PPIase活性。
　　 結(jié)論:成功克隆了人CypD