Theromin基因的克隆、表達(dá)及融合蛋白活性研究.pdf

1、Theromin基因的克隆、表達(dá)及融合蛋白活性研究摘要爭(zhēng)栓栓塞性疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康，新型凝血酶直接抑制齊。有望克服傳統(tǒng)抗凝藥的應(yīng)用缺陷，已成為當(dāng)今心血管藥物研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。Theromi。蛋白抗凝血活性高，具有較高的應(yīng)用前景J深妥碳據(jù)Theromin蛋白的氨基酸序列，設(shè)計(jì)了重組的theromin星旦。將重組theromin基因全基因合成后克隆于pEZZ18表達(dá)載體上，構(gòu)建成P.。及pspa雙重啟動(dòng)子控制下的ZZTheromin

2、融合表達(dá)質(zhì)粒pEZZT。轉(zhuǎn)化到E.coliJM109后，融合蛋白以可溶形式大部分分泌至周質(zhì)間隙和培養(yǎng)基中。經(jīng)SDSPAGE檢測(cè)融合蛋白呈現(xiàn)分子量為43KD和22KD的主帶。融合蛋白經(jīng)過(guò)IgGsepharose分離純化后，產(chǎn)量達(dá)1.2mgL培養(yǎng)基，抗凝血酶活性為1101UImg融合蛋白。純化的融合蛋白產(chǎn)物經(jīng)過(guò)腸激酶切割，SDSPAGE顯示出現(xiàn)14KD的主帶，與天然Theromin蛋白分子量一致。此外，本文還對(duì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化進(jìn)行了初步嘗試，

3、為今后進(jìn)一步研究Theromin蛋白的結(jié)構(gòu)與功能打下了基礎(chǔ)。關(guān)。詞:theromin，克廖融合蛋多分泌表9pEZZ一~一一，，，，，，.........—一文獻(xiàn)綜述血栓是由不同的臨床病理情況、手術(shù)狀態(tài)造成的復(fù)雜的井發(fā)癥。臨床病理上將其分為3種類型:冠狀動(dòng)脈疾病形成血栓，主要是指急性心肌梗死:腦血管疾病形成血栓，即腦血栓中風(fēng)末梢動(dòng)靜脈疾病形成血栓，即脈管栓塞。血栓栓塞性疾病已經(jīng)嚴(yán)重威脅著人們的生存和健康。據(jù)報(bào)道，在美國(guó)每年有30000人由

4、于靜脈栓塞而入院.其中12%的病人因此而死亡。肺栓塞每年會(huì)造成50000到250000人的死亡?，F(xiàn)有預(yù)防和治療技術(shù)的貧乏、極大的臨床治療的需要和近期生物技術(shù)的發(fā)展都觸動(dòng)人們尋找能夠控制血栓形成過(guò)程中的特定靶位的新藥。如今，世界上很多著名的醫(yī)藥公司都在致力于新型抗凝血藥物的研究。AntiplateletagentsAntithromboticagentsFibrinolyticagentsAbcxabAspirinClopidogrelD

5、ipyridamoleEpoprostanolTiclopidineHeparinandheparinlikecompoundsDirectthrombininhibitorsWarfarinStreptokinaseTissueplasminogenactivator(tPA)Table1.EstablishedAntithromboticAgents目前最基本的預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病的方法是應(yīng)用溶栓藥、抗凝藥、抗血小板藥的抗血栓療

6、法‘。。這三種藥物都有不同的作用靶位:溶栓藥促進(jìn)血塊的溶解抗凝藥抑制凝血酶的生成、血纖維蛋白的形成:抗血小板藥物可以抑制血小板的凝聚。傳統(tǒng)的抗凝藥，如非組分肝素、低分子量肝素、丙酮節(jié)輕香豆素(法華令)，雖然具有一定的效果，但是它們也往往帶有嚴(yán)重的應(yīng)用限制性?？鼓幬锟赏岣邉?dòng)靜脈血栓性栓塞，進(jìn)行性腦卒、肺栓塞的治療效果，因此尋找有效的抗凝抗栓新藥成為當(dāng)今心血管藥物研究領(lǐng)域的主要研究方向之一。“凝血酶的直接抑制劑”是一較新的抗凝藥的概念。