SARS冠狀病毒Mc區(qū)的克隆表達及表達蛋白抗原活性研究.pdf

1、目的:SARS冠狀病毒是一種新現(xiàn)的病原微生物，屬于巢狀病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，基因組為單鏈正RNA。SARS-CoV可引起嚴重急性呼吸綜合征，傳染性強，死亡率高。首發(fā)病例于2002年11月出現(xiàn)在中國廣東，疫情很快波及全球。目前，SARS暫時得到控制，但在SARS防治中許多關(guān)鍵問題尚待解決，如SARS-CoV入侵細胞及致病機制、特異性抗病毒藥物、快速診斷試劑和疫苗的研制等。 研究表明，冠狀病毒S蛋白(棘突蛋白)和M蛋白(膜

2、蛋白)具有免疫原性，能夠誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生。M蛋白是最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，它跨膜雙分子層3次，短氨基端在膜外，長羧基端在膜內(nèi)，由121個氨基酸組成，被認為是與核蛋白體作用的區(qū)域。 本項研究分析了82株SARS-CoVM基因的變異情況，發(fā)現(xiàn)氨基酸變異主要發(fā)生在膜外和跨膜區(qū)域，膜內(nèi)區(qū)域變異極少。對SARS-CoVM蛋白的B細胞抗原表位進行預(yù)測，結(jié)果表明M蛋白的B細胞抗原表位85％以上都位于M蛋白膜內(nèi)區(qū)(Mc蛋白)[6]。另有研究者預(yù)測，M

3、蛋白所含T細胞激活表位主要集中在第81-220位氨基酸之間，占84.7％，即主要集中在Mc蛋白區(qū)域內(nèi)[7]。所以，就抗原活性而言，Mc蛋白應(yīng)是M蛋白的代表區(qū)段，而且Mc蛋白的疏水性小于M蛋白的疏水性，更易于大量體外表達。因此，本項研究將靶蛋白鎖定為Mc蛋白。對SARS冠狀病毒M基因膜內(nèi)部分(Mc區(qū))進行擴增、克隆，在原核系統(tǒng)中表達，表達蛋白純化、復(fù)性后，對其抗原活性進行初步研究。 結(jié)論: 1、生物信息學(xué)分析結(jié)果提示，Mc

4、區(qū)為M蛋白中B細胞抗原表位相對集中區(qū)段。 2、構(gòu)建的原核重組表達質(zhì)粒pET32a(+)/Mc，經(jīng)誘導(dǎo)后，可表達以包涵體形式存在的融合蛋白，分子量約為34KDa，含有6×his組氨酸標(biāo)簽有利于蛋白初步鑒定與純化。 3、通過復(fù)性，獲得具有生物活性的Mc蛋白。免疫新西蘭大白兔產(chǎn)生多抗，Mc蛋白及其多抗間可發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，表明獲得的Mc蛋白具有良好的抗原活性。Mc蛋白不與兔抗OC43和229E血清發(fā)生反應(yīng)，推測SARS-CoV