SARS冠狀病毒傳代后遺傳穩(wěn)定性及重組S蛋白的表達(dá)與分析.pdf

1、嚴(yán)重急促呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)是由一種新的冠狀病毒引起的傳染性呼吸道疾病，嚴(yán)重危害了人民群眾的身體健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，從2002年11月廣東發(fā)生第一例SARS病例始，到2003年8月7日，全世界共有8442人患病，死亡916人，病死率是11％。 SARS病毒與其它RNA病毒一樣，有復(fù)制易出錯(cuò)的傾向，因此在傳染或傳代過(guò)程中容易發(fā)生突變，這種機(jī)制有利于病毒逃脫宿主的免疫系統(tǒng)而生存下來(lái)。許多研究已表明不同的SARS病毒分離株

2、的全基因組序列存在不同程度的變異，顯然，這些變異的研究對(duì)SARS病毒疫苗的研制具有重要的指導(dǎo)意義。此外，對(duì)SARS病毒在傳代過(guò)程中的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，也可以為SARS滅活疫苗的研制提供必要的參考。本研究采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法，對(duì)兩株用于SARS滅活疫苗研制的，在Vero細(xì)胞上多次傳代的SARS病毒進(jìn)行了全基因組序列的測(cè)定，通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)該病毒在傳代過(guò)程中具有高度遺傳穩(wěn)定性：其中檢定參比株(Sinol株)2代和11代全基因組序列

3、比較有四個(gè)堿基的變化，而候選疫苗株(Sino3株)3代與10代的基因組全序列僅有一個(gè)堿基的差異。SARS病毒在Vero細(xì)胞上傳代的遺傳穩(wěn)定性表明通過(guò)細(xì)胞大量培養(yǎng)SARS病毒制作滅活疫苗是可行的。 此外，大量研究表明S蛋白可以誘導(dǎo)產(chǎn)生SARS-CoV中和抗體，也有報(bào)道稱，僅S1蛋白或其受體結(jié)合區(qū)就可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)酵母密碼子的偏好性，用PCR的方法合成了S蛋白受體結(jié)合區(qū)處的堿基序列：S303和S318，并將S318分

4、別克隆到原核表達(dá)載體pET30a和酵母表達(dá)載體pPIC9K中；同時(shí)也構(gòu)建了S1蛋白的原核及真核表達(dá)載體和S303的酵母表達(dá)載體。S318、S1在大腸桿菌中都以包涵體的形式表達(dá)，其中，S318的表達(dá)量為100mg/L，明顯高于S1的20mg/L。純化后的重組蛋白能夠很好地與SARS滅活全病毒免疫小鼠血清和SARS恢復(fù)期病人血清發(fā)生免疫反應(yīng)，表明其具有抗原性。同時(shí)，通過(guò)梯度透析復(fù)性的方法，對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行復(fù)性。并對(duì)復(fù)性后重組蛋白進(jìn)行質(zhì)

5、譜分析，利用所得的肽質(zhì)量指紋譜(PMF)與蛋向肽庫(kù)或已知氨基酸序列的蛋白的理論肽質(zhì)量指紋譜進(jìn)行比較，表明純化復(fù)性后的重組蛋白為目的蛋白，且純度很高，基本不含雜蛋白。復(fù)性后的重組蛋白免疫昆明小白鼠，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體，其抗血清能與重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，與SARS冠狀病毒(變異株)裂解液包被抗原呈陽(yáng)性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)表明重組蛋向具有很好的抗原性，可以用于SARS的診斷和重組亞單位疫苗的研究。比較遺憾的是，在畢赤酵母中沒(méi)有檢測(cè)到S1、S