腸道病毒71型基因組研究和SARS冠狀病毒結構蛋白的鑒定與分析.pdf

1、該文對腸道病毒71型(SHZH03毒株)進行了全基因組序列測定,利用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)表達了腸道病毒71型外殼蛋白VP2,對SARS冠狀病毒的核蛋白(N)和突起了糖蛋白(S)進行了鑒定與分析,研究結果如下:1.腸道病毒71型(SHZH03毒株)全基因組序列測定.對腸道病毒71型(enterovirus 71, EV71)中國(深圳)分離株SHZH03基因組建立了覆蓋全基因組的8個首尾重疊的克隆,并在此基礎上對全基因組(未包括多聚腺苷酸尾

2、)的7406個堿基進行了核苷酸序列的測定和分析.結果提示了中國深圳地區(qū)流行的腸道病毒71型有可能來源于臺灣1998年的EV71大規(guī)模流行時的毒株,對于中國EV71的基因分型、分子流行病學研究、EV71流行規(guī)律和疾病的治療與預防都有借鑒意義.2.腸道病毒71型外殼蛋白VP2在巴斯德畢赤酵母中的表達.從細胞培養(yǎng)物中提取EV71病毒基因組RNA,再利用RT-PCR技術,擴增出EV71外殼蛋白基因VP2,連接于T載體,經(jīng)測序證實目的基因VP2的

3、序列正確;構建酵母分泌型表達質粒pPIC9K/VP2,經(jīng)序列測定證實α-factor信號肽和VP2的序列和閱讀框正確后,經(jīng)SacI酶切使之線性化,用電轉化法將目的基因轉化并整合到宿主菌GS115基因組中;經(jīng)G418加壓篩選多拷貝整合菌株、轉化子表型篩選和PCR分析鑒定后以及甲醇誘導,在Pichia pastoris酵母中實現(xiàn)了VP2的高效分泌性表達.經(jīng)飽和硫酸胺分級沉淀法初步純化后,重組蛋白VP2的純度可達90﹪以上.3.SARS冠狀病