樹鼩腸道病毒宏基因組的初步研究及毛滴蟲的鑒定.pdf

1、樹鼩，屬攀鼩目、樹鼩科，形態(tài)酷似松鼠，相比嚙齒類動(dòng)物，樹鼩的基因組與轉(zhuǎn)錄組更近似于靈長類動(dòng)物。文獻(xiàn)報(bào)道樹鼩已被廣泛用于肝炎病毒、金黃色葡萄球菌、馬錐蟲等感染研究，但報(bào)道中所用樹鼩多是野生型，還沒有實(shí)現(xiàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性不好。因此，樹鼩質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)于其在生命科學(xué)研究的應(yīng)用具有重要的科學(xué)意義，而病原微生物和寄生蟲的感染及致病情況都是監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)。目前采用傳統(tǒng)方法已從樹鼩身上檢測(cè)到皰疹病毒、腺病毒、呼腸孤病毒等，但是報(bào)道

2、仍少且不全面，而且病毒的發(fā)現(xiàn)受限于傳統(tǒng)方法。病毒宏基因組學(xué)是以環(huán)境中病毒核酸為研究對(duì)象，整體剖析病毒群落的組成的研究技術(shù)，規(guī)避了傳統(tǒng)方法的限制。因此，為了全面地調(diào)查我國野生樹鼩腸道病毒多樣性，本文采用病毒宏基因組學(xué)對(duì)50份野生樹鼩糞便的病毒核酸進(jìn)行研究分析。
　　本文通過QPCR對(duì)PEG沉淀結(jié)合超聲分離法、鐵離子絮凝法、GBviroFast病毒濃縮試劑盒以及超高速離心法濃縮糞便上清的病毒定量，獲得最佳的糞便上清病毒濃縮方法。采用I

3、llumina HiSeq4000測(cè)序及生物信息學(xué)分析，對(duì)50份野生滇西亞種樹鼩糞便樣本進(jìn)行了病毒宏基因組的分析。采用直接涂片和碘液染色鏡檢對(duì)樹鼩體內(nèi)的毛滴蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;經(jīng)傳統(tǒng)方法提取蟲體總DNA，PCR擴(kuò)增該毛滴蟲的18S rRNA以及5.8S rRNA，測(cè)序后經(jīng)BLAST進(jìn)行同源性分析，并應(yīng)用MEGA6.06繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。
　　研究結(jié)果表明：(1)PEG沉淀病毒方法的濃縮效率為6.13％、鐵離子絮凝法的濃縮效率為49

4、.57％、GBviroFast的濃縮效率為26.12％、超高速離心的濃縮效率為29.9％，鐵離子絮凝法濃縮效率最高，后期用于糞便上清病毒的濃縮。(2)本次研究共獲得了20195972條讀長(Reads)，通過與病毒相關(guān)數(shù)據(jù)庫(Virus Refseq、VirusNT以及Acalme)進(jìn)行比較，其中1177922條序列與病毒（包括噬菌體）相關(guān)。與動(dòng)物病毒同源的序列包括：小RNA病毒科(16％)和皰疹病毒科(6％)，其它還匹配到樹鼩細(xì)環(huán)病毒

5、、樹鼩腺病毒。與噬菌體同源的序列包括Siphoviridae(27％)、Microviridae(26％);一些樹鼩病毒序列匹配到了昆蟲病毒(1％)和植物病毒(1％)，如，Densoviridae、花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)。除了病毒序列，還獲得了原蟲的序列，如卡氏棘阿米巴、惡性瘧原蟲以及陰道毛滴蟲。(3)形態(tài)學(xué)觀察表明樹鼩體內(nèi)的鞭毛蟲為三毛滴蟲和五毛滴蟲;測(cè)序分析表明樹鼩三毛滴蟲18S rRNA與已報(bào)道的胎兒三毛

6、滴蟲18S rRNA(AY754332.1)同源性高達(dá)99％，5.8S rRNA序列與胎兒三毛滴蟲18S rRNA(AF466749.1)同源性高達(dá)99％;此外，樹鼩五毛滴蟲5.8SrRNA序列與環(huán)境中的五毛滴蟲(KT203771.1)同源性高達(dá)99％，與人五毛滴蟲同源性(AF156964.1)高達(dá)97％。
　　本研究初步確定了云南地區(qū)滇西亞種樹鼩糞便中的病毒譜，植物病毒和昆蟲病毒的存在與樹鼩的飲食習(xí)慣和棲息地相關(guān)。樹鼩體內(nèi)的毛滴