陰道毛滴蟲RRas基因克隆,表達(dá)及鑒定.pdf

1、陰道毛滴蟲是一種性傳播原生動物寄生蟲,致病機(jī)制尚不清楚。RRas蛋白已證實在細(xì)胞的生長、分化、細(xì)胞增殖，細(xì)胞骨架、細(xì)胞粘著和遷移中發(fā)揮重要作用。陰道毛滴蟲RRas蛋白與人類有相似的結(jié)構(gòu)域和功能域，是否對陰道毛滴蟲致病性有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。
　　本研究采用基因工程技術(shù)一步克隆并表達(dá)了陰道毛滴蟲RRas基因。將重組蛋白純化后，免疫 BALB/c小鼠，測其效價,獲得重組蛋白免疫血清，應(yīng)用SDS-PAGE和Western blot技術(shù)分

2、析該重組蛋白的免疫原性，并為其在陰道毛滴蟲組織內(nèi)定位做準(zhǔn)備。利用CCK8試劑盒檢測陰道毛滴蟲 RRas蛋白對人類腫瘤細(xì)胞增殖的作用，為探討陰道毛滴蟲RRas蛋白對人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展作用做準(zhǔn)備。
　　材料與方法：
　　1.陰道毛滴蟲蟲株、質(zhì)粒，菌株，實驗動物及細(xì)胞系
　　陰道毛滴蟲（陰道毛滴蟲分離株來自鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科門診女性患者）。BALB/c小鼠（雌性、四周齡，河南省實驗動物中心）PQE-80L質(zhì)粒，BL2

3、1菌株(由本實驗室保存)，所用細(xì)胞系為人宮頸癌（HeLa）細(xì)胞系（由本實驗室保存）食管癌（Eca-109）細(xì)胞系（病理教研室保存）。
　　2.陰道毛滴蟲RRas基因的一步克隆與表達(dá)登陸GenBank查陰道毛滴蟲RRas基因的mRNA序列，結(jié)合 PQE-80L質(zhì)粒的克隆位點及同源重組序列設(shè)計上下游引物。，提取陰道毛滴蟲的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR反應(yīng)獲得目的基因經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，將其克隆至線性化后的表達(dá)載體P

4、QE-80L，對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，鑒定正確后，將 PQE-80L-Tv RRas轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。對重組質(zhì)粒進(jìn)行菌落 PCR,雙酶切及測序鑒定，鑒定后，用合適濃度IPTG誘導(dǎo)陽性BL21，收集菌體沉淀，經(jīng)一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE，觀察否有目的蛋白表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物的可溶性進(jìn)行分析。
　　3.陰道毛滴蟲重組蛋白PQE-80L-TvRRas純化及鑒定
　　用異丙基-β-D-硫代

5、半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，用生工生物活性蛋白提取試劑盒提取蛋白，可溶性鑒定后，目的蛋白用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒親和層析純化。進(jìn)行Western blot分析，鑒定陰道毛滴蟲重組AP51蛋白的免疫原性及抗原性。
　　4.陰道毛滴蟲重組蛋白對人類腫瘤細(xì)胞增殖的作用
　　重組蛋白PQE-80L-TvRRas和人hela細(xì)胞及Eca-109細(xì)胞共培養(yǎng)一個細(xì)胞周期后，用CCK8試劑盒檢測其對腫瘤細(xì)胞增殖的作

6、用。
　　結(jié)果：
　　1.通過雙酶切及測序鑒定，結(jié)果顯示PQE-80L-TvRRas重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（0.5mmol/mlIPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示在26 kDa處新增加一條帶，表明重組蛋白表達(dá)成功。所克隆的陰道毛滴蟲RRas基因?qū)﹂L度為664bp,編碼蛋白含有204個氨基酸，等電點為4.81，蛋白大小約為23.6kd，對該蛋白進(jìn)行可溶性鑒定發(fā)現(xiàn)其以可溶性形式表達(dá)。
　

7、　2. Western blot結(jié)果表明，抗 His標(biāo)簽鼠單克隆抗體能夠識別 PQE-80L-Tv RRas蛋白，陰道毛滴蟲重組蛋白可被陰道毛滴蟲可溶性抗原免疫BALB/c小鼠血清識別，而不能被正常BALB/c小鼠血清識別。陰道毛滴蟲可溶性蛋白可被陰道毛滴蟲重組蛋白免疫 BALB/c小鼠血清識別，而不能被正常 BALB/c小鼠血清識別。均在約24KD處顯示明顯條帶，表明該蛋白有較好的抗原性及免疫原性。
　　3.CCK8細(xì)胞增殖結(jié)果