陰道毛滴蟲可溶性抗原組分分析.pdf

1、陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)是一種常見的性傳播疾病，人群普遍易感。據(jù)報道全世界每年約有170萬感染病例。陰道毛滴蟲是一種具有鞭毛的寄生性原蟲，人體感染后可引起一系列的臨床癥狀。約50﹪的婦女感染陰道毛滴背景和目的 蟲后無任何癥狀，其中1/3的婦女6個月內(nèi)可發(fā)展成為有癥狀的感染者。急性感染可出現(xiàn)宮頸陰道黏膜上皮出血、脫落等急性陰道炎癥狀。慢性感染可引起性交時癢痛。此外研究表明滴蟲病與宮頸癌、非典型盆腔炎癥

2、、婦女不育癥有關(guān)。孕婦感染陰道毛滴蟲后可導(dǎo)致胎膜早破、早產(chǎn)，低體重兒。男性感染陰道毛滴蟲后大多無癥狀，部分可引起尿道炎，前列腺炎。另外陰道毛滴蟲也是增加人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的因素。陰道毛滴蟲最常見的病原學(xué)診斷方法是在顯微鏡下直接觀察。該診斷方法盡管操作簡便且所需費用較低，但敏感度較差，與培養(yǎng)法相比較敏感度僅達到其35﹪-80﹪，同時要求檢驗人員有較豐富的臨床診斷經(jīng)驗。目前被公認(rèn)的診斷陰道毛滴蟲感染“金標(biāo)準(zhǔn)”是培養(yǎng)法，常用的培養(yǎng)

3、基包括Diamond's,Trichosel和InPouchTV培養(yǎng)基。但尚無任何一種培養(yǎng)基，單一診斷陰道毛滴蟲感染時敏感度達到100﹪，且該方法費時費力，診斷費用較昂貴。國內(nèi)外學(xué)者對陰道毛滴蟲感染的免疫學(xué)診斷進行了大量研究，由于抗原成份復(fù)雜，對該蟲感染者進行免疫學(xué)診斷時，其抗原常與其他寄生蟲病患者的血清交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性，特異性較差。為了尋找診斷該病的特異性抗原，本研究應(yīng)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對陰道

4、毛滴蟲可溶性抗原進行分析，然后與經(jīng)該蟲免疫小鼠血清進行免疫印跡(Western blot)，為建立敏感、特異的滴蟲感染免疫學(xué)診斷方法奠定基礎(chǔ)。 材料與方法 1．陰道毛滴蟲蟲體培養(yǎng)陰道毛滴蟲蟲株取自婦女陰道分泌物，接種到肝浸湯進行培養(yǎng)。蟲體培養(yǎng)生長24h后，室溫下離心(500×g)蟲體，后用PBS緩沖液(pH7．2)洗滌。 2．陰道毛滴蟲蟲體可溶性抗原制備蟲體分別反復(fù)凍融、超聲粉碎、離心，取上清作為蟲體可溶性抗原，

5、并測定抗原的濃度。 3．陰道毛滴蟲蟲體多克隆抗體制備BALB/c小鼠每5只隨機分為一組進行免疫，以在-80℃冷凍保存?zhèn)溆玫年幍烂蜗x蟲體作為抗原，采用背部皮下多點注射進行免疫。首次免疫采用福氏(Freund adjuvant)完全免疫佐劑，加強免疫采用福氏不完全免疫佐劑，佐劑與抗原的體積之比為1：1。每2周免疫一次，在第2次加強免疫2周后通過眼球取小鼠血，獲取鼠抗陰道毛滴蟲蟲體血清。 4．抗體效價檢測ELISA檢測鼠抗陰道毛滴蟲

6、蟲體血清抗體滴度。 5．樣品制備可溶性抗原與樣品緩沖液1：4混合，在100℃熱水中加熱3-5分鐘。 6，SDS-PAGE用Bio-Rad電泳系統(tǒng)對上述抗原進行SDS-PAGE分析，采用10﹪的分離膠和5﹪的濃縮膠。充分染色、褪色后可看到各自不同的電泳帶。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量蛋白帶的遷移率及其分子量的對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測量各條蛋白帶的遷移率，查出與其對應(yīng)的分子量。 7．Western blot抗原轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上

7、采用Western blot對陰道毛滴蟲蟲體可溶性抗原進行免疫分析。 結(jié)果 1．鼠抗陰道毛滴蟲蟲體免疫血清抗體滴度檢測陰道毛滴蟲蟲體3次免疫小鼠半月后，取血清經(jīng)ELISA檢測血清抗體滴度達1：100 000。 2．電泳樣本蛋白含量的選擇加樣孔內(nèi)蛋白含量的不同，電泳帶清晰度有所差異。樣品濃度越高，加樣量越少，電泳效果越好，用Bio-Rad公司的Mini電泳系統(tǒng)時，加樣量在18μg/孔，電泳效果最好。 3．陰

8、道毛滴蟲蟲體可溶性抗原電泳分析陰道毛滴蟲全蟲可溶性抗原經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色顯示32條蛋白帶。在32條全蟲抗原蛋白帶中，分子量在100kDa以上有9條，其余在15～97kDa之間，主帶有8條，分別是110、97、75、60、57、34、26、和15kDa。 5．陰道毛滴蟲蟲體可溶性抗原免疫印記分析在SDS-PAGE凝膠中的陰道毛滴蟲可溶性抗原32條蛋白帶中顯示廣泛的免疫反應(yīng)，除86、75和22kDa處均未顯示棕色條帶

9、，無免疫原性，其余各條蛋白帶均有反應(yīng)。且以110、97、60和26kDa免疫反應(yīng)性最強，顯色最深為主要反應(yīng)帶。值得注意的是，SDS-PAGE凝膠考馬斯亮藍染色不清楚的蛋白帶經(jīng)酶聯(lián)免疫染色后變?yōu)榍逦梢?，如大于lOOkDa的3條蛋白帶，90、72、46及18kDa?？梢娪行┑蜗x抗原量雖少，卻可產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)。 結(jié)論 1. 陰道毛滴蟲蟲體可溶性抗原電泳分析陰道毛滴蟲全蟲可溶性抗原有32條蛋白帶，主帶為110、97、75、