陰道毛滴蟲、小鼠LAG1基因啟動(dòng)子區(qū)分析和陰道毛滴蟲肌動(dòng)蛋白cDNA克隆、表達(dá).pdf

1、研究目的:(1)克隆并分析小鼠及陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)長壽保障基因LAG1啟動(dòng)子,為進(jìn)一步研究在細(xì)胞衰老過程中LAG1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定基礎(chǔ);(2)克隆陰道毛滴蟲肌動(dòng)蛋白基因片段,表達(dá)及純化肌動(dòng)蛋白重組蛋白,免疫豚鼠獲得抗血清,為進(jìn)一步研究肌動(dòng)蛋白在陰道毛滴蟲體內(nèi)定位及其在細(xì)胞衰老過程中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　材料與方法:(1)利用Promoter2.0在線分析軟件(http://www.cbs.d

2、tu.dk/ervices/Promoter/),取LAG1(LASS1)基因起始密碼子上游約3000bp進(jìn)行分析,根據(jù)分析結(jié)果,用PCR技術(shù)擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)序列,將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T-Easy載體,并分別亞克隆入熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic及增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因載體pEGFP-1,用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞,48h后測(cè)定熒光素酶表達(dá)活性及觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。(2)應(yīng)用PCR方法獲得陰道毛滴

3、蟲肌動(dòng)蛋白基因部分片段,克隆入pGEM-T-Easy載體,并亞克隆入表達(dá)載體pET-41a,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌(E.coli)BL21,異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá),親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物,Brandford法測(cè)定重組蛋白含量并免疫豚鼠,用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行分析鑒定。
　　結(jié)果:(1)通過在線啟動(dòng)子分析軟件發(fā)現(xiàn)在陰道毛滴蟲

4、LAG1基因5′端-400bp~+50bp區(qū)域內(nèi)含有啟動(dòng)子的可能性很大,雖然在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近缺乏經(jīng)典的TATA,CAAT及 GC保守序列,但檢測(cè)到5個(gè)GATA-1、七個(gè)Oct-1結(jié)合位點(diǎn)保守序列。據(jù)此設(shè)計(jì)了六對(duì)引物并構(gòu)建了六種熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)體系及兩種增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)體系,其中表達(dá)載體pGL3-455(-455bp~+55bp)、pGL3-417(-417bp~+55bp)、pGL3-280(-280bp~+55bp)

5、、pGL3-202(-202bp~+55bp)、pGL3-81(-81bp~+55bp)的熒光素酶表達(dá)活性相近,均明顯高于表達(dá)載體pGL3-47(-47~+55)熒光素酶表達(dá)活性,而pGL3-47表達(dá)載體熒光素酶表達(dá)活性極低,與陰性對(duì)照活性相近,提示-47bp~+55bp區(qū)無啟動(dòng)子活性。綠色熒光蛋白的表達(dá)情況為pEGFP-81(-81bp~+55bp)有明顯的綠色熒光蛋白表達(dá),而pEGFP-47(-47bp~+55bp)和空載體pEGF

6、P-1未見表達(dá)。(2)通過在線啟動(dòng)子分析軟件發(fā)現(xiàn)在小鼠LASS1基因5′端-600bp~+50bp區(qū)域內(nèi)含啟動(dòng)子的可能性較大,而且在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近未發(fā)現(xiàn)保守的TATA盒,CAAT盒及GC盒等典型的啟動(dòng)子元件,但檢測(cè)到兩個(gè)SP1結(jié)合位點(diǎn)保守序列。兩個(gè)SP1結(jié)合位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-181bp區(qū)域內(nèi)。據(jù)此設(shè)計(jì)了三對(duì)引物并構(gòu)建了三種熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)體系及三種增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)體系,分別為pGL3-501(-501bp~+10

7、6bp)、pGL3-181(-181bp~+106bp)和pGL3-26(+26~+106)及pEGFP-501、 pEGFP-181和pEGFP-26。pGL3-501表達(dá)載體與pGL3-181表達(dá)載體熒光素酶表達(dá)活性相近,而pGL3-26表達(dá)載體熒光素酶表達(dá)活性極低,與陰性對(duì)照活性相近,+26bp~+106bp無啟動(dòng)子活性。綠色熒光蛋白的表達(dá)情況也類似, pEGFP-501和pEGFP-181有明顯的綠色熒光蛋白表達(dá),而pEGFP-

8、26和空載體pEGFP-1無表達(dá)活性。(3)肌動(dòng)蛋白基因的PCR產(chǎn)物片段大小500bp;構(gòu)建了陰道毛滴蟲肌動(dòng)蛋白基因重組表達(dá)質(zhì)粒;表達(dá)了肌動(dòng)蛋白重組蛋白;SDS-PAGE顯示分離純化的肌動(dòng)蛋白重組蛋白為47kDa;Western blot結(jié)果表明所獲得抗血清可與肌動(dòng)蛋白重組蛋白在47kDa及陰道毛滴蟲總蛋白在41kDa處特異性反應(yīng)。
　　結(jié)論:(1)在陰道毛滴蟲LAG1基因5′端-81bp~-47bp區(qū)域含有基因轉(zhuǎn)錄所必需的基本啟