陰道毛滴蟲Tvmar1基因多態(tài)性與相關(guān)因素研究及Fd基因測序.pdf

1、背景和目的:
　　陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis,Tv)是一種寄生于人體泌尿生殖道的帶鞭毛的寄生原蟲。它可以引起陰道毛滴蟲病(trichomoniasis),還會增加如艾滋病和乙型肝炎等性傳播疾病(sexually transmitted disease,STD)感染的機(jī)會。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全世界每年陰道毛滴蟲感染者超過1.7億。該蟲對人體危害極大,而且流行廣泛。人型支原體(Mycoplasma hom

2、inis,Mh)也是一種寄生于人體泌尿生殖道的病原體,是已知能獨(dú)立生存的最小的微生物。它與陰道毛滴蟲可引起類似的并發(fā)癥:不育癥、自發(fā)性流產(chǎn)、低出生體重兒等。國外學(xué)者對于它們之間的聯(lián)系報道較早,國內(nèi)有關(guān)資料較少,本研究通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測手段,對陰道毛滴蟲進(jìn)行人型支原體檢測,了解河南地區(qū)陰道毛滴蟲與人型支原體的共生情況,并為臨床治療提供理論依據(jù)。本研究利用移動遺傳因子(mob

3、ile genetic element,MGE)—PCR技術(shù)分析來自河南5個城市(鄭州、安陽、洛陽、新鄉(xiāng)、開封)的30個陰道毛滴蟲樣本的遺傳多態(tài)性,明確它們之間的親緣關(guān)系,并根據(jù)我們獲得的陰道毛滴蟲的相關(guān)資料:蟲株的地理來源、人型支原體的寄生及滴蟲病患者的臨床癥狀和體征(分3度:輕度、中度、重度),分析這些相關(guān)因素與陰道毛滴蟲遺傳多態(tài)性的聯(lián)系,為我省開展陰道毛滴蟲分子流行病學(xué)研究提供有價值的分子數(shù)據(jù)。作為最原始的真核生物,陰道毛滴蟲缺乏

4、線粒體,其特有的雙層膜結(jié)構(gòu)氫化酶體是蟲體的主要代謝器官。而鐵氧還蛋白(ferredoxin,Fd)作為氫化酶體代謝過程中重要的電子傳遞介體,在藥物的激活中起關(guān)鍵作用。近年來,由于陰道毛滴蟲耐藥株的產(chǎn)生,許多學(xué)者開始關(guān)注Fd。本研究用PCR擴(kuò)增出Fd基因,選取部分陰道毛滴蟲的Fd基因直接測序,探討陰道毛滴蟲和人型支原體的共生以及地理來源的不同是否影響Fd基因,為臨床治療提供依據(jù)。
　　材料與方法:
　　研究所用陰道毛滴蟲蟲株均

5、由鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院的婦產(chǎn)科或檢驗科提供,且全部采集自女性患者。并詳細(xì)記錄每個病人的臨床資料。本研究選取30個陰道毛滴蟲樣本,培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用酚—氯仿法提取基因組DNA,并測定DNA的純度和濃度。利用MGE—PCR技術(shù),分析30個陰道毛滴蟲樣本Tvmar1基因的長度和位置的多態(tài)性,利用鄰位相連法(neighbour-joining,NJ),并借助MEGA3.1分析軟件,以Tvmar1基因的位置變化為基礎(chǔ)構(gòu)建30株陰道毛滴蟲的聚類樹狀圖

6、。用PCR技術(shù)對共生于陰道毛滴蟲中人型支原體進(jìn)行鑒定和Fd基因的擴(kuò)增。選取部分陰道毛滴蟲包括人型支原體和陰道毛滴蟲共生的陽性株和陰性株及來自5個不同城市的蟲株,將它們的Fd基因送到生物公司直接測序。
　　結(jié)果
　　1.陰道毛滴蟲體內(nèi)的人型支原體的PCR檢測結(jié)果顯示,30株陰道毛滴蟲蟲株中有25株擴(kuò)增出DNA片段長度為334bp的特異產(chǎn)物,可判定為陽性,5株未能擴(kuò)出目的基因,判定為陰性。陽性率為83.33％。
　　2.利

7、用MGE—PCR方法研究陰道毛滴蟲蟲株間的Tvmar1基因遺傳多態(tài)性,結(jié)果顯示,陰道毛滴蟲種間的遺傳差異明顯,遺傳距離在0到100％間均有分布(平均遺傳距離為69.11％,平均遺傳相似系數(shù)為30.89％。根據(jù)遺傳距離構(gòu)建的樹狀聚類圖,發(fā)現(xiàn)有5個組的蟲株間([Tv12、Tv29];[Tv18、Tv20];[Tv14、Tv26];[Tv10、Tv25];[Tv15、Tv21])遺傳關(guān)系最為密切,遺傳距離為0。
　　3.陰道毛滴蟲Fd基

8、因的擴(kuò)增結(jié)果顯示,30個蟲株均可擴(kuò)增出DNA片段長度為300bp的特異產(chǎn)物。測序結(jié)果應(yīng)用Clustalx軟件比對,發(fā)現(xiàn)10株陰道毛滴蟲的Fd基因序列完全相同,但與GenBank中的Fd基因序列(M33717)進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)在第200位多出ctg3個堿基,多編碼1個亮氨酸,但并未導(dǎo)致讀碼框架改變?；虻耐葱詾?9％。未發(fā)現(xiàn)地理來源和有無人型支原體共生對河南地區(qū)陰道毛滴蟲Fd基因產(chǎn)生影響。
　　結(jié)論:
　　1.河南地區(qū)陰道