陰道毛滴蟲衰老相關(guān)基因消減雜交文庫構(gòu)建及Tv-Sir2-like基因功能研究.pdf

1、研究目的：(1)構(gòu)建模式生物陰道毛滴蟲衰老相關(guān)基因差異表達(dá)消減雜交文庫,篩選陰道毛滴蟲細(xì)胞衰老相關(guān)基因。(2)克隆陰道毛滴蟲細(xì)胞的SIR2同源基因:Tv-SIR2-like。構(gòu)建Tv-SIR2-like原核表達(dá)重組質(zhì)粒及表達(dá)其重組蛋白。
　　材料和方法：建立模式生物陰道毛滴蟲的研究體系,即攝入正常熱量的正常生長(zhǎng)細(xì)胞模型和限制熱量攝入的長(zhǎng)壽細(xì)胞模型。在此基礎(chǔ)上采用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建陰道毛滴蟲細(xì)胞衰老相關(guān)基因cDNA文庫并分離和篩

2、選細(xì)胞衰老相關(guān)基因。從陰道毛滴蟲cDNA表達(dá)文庫中篩選SIR2的同源基因,并對(duì)其序列保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源性分析。構(gòu)建Tv-SIR2-like基因原核表達(dá)重組子,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的基因融合蛋白。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建正常生長(zhǎng)型和長(zhǎng)壽型模式生物陰道毛滴蟲細(xì)胞差異表達(dá)基因消減雜交cDNA文庫。從正向和反向兩個(gè)消減雜交文庫中各隨機(jī)篩選出100個(gè)克隆進(jìn)行酶切鑒定,分別得到250-700bp大小不等的插入片段。測(cè)序及序列同源性分析結(jié)果顯示,正向

3、和反向兩個(gè)消減雜交文庫之間沒有彼此重復(fù)的序列。從正常生長(zhǎng)型陰道毛滴蟲細(xì)胞的消減雜交文庫中得到三個(gè)已知的基因(分別是:Fructose-1,6-bisphosphate aldolase,40Sribosomal protein及N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase),以及5個(gè)未知基因的序列,可能是新基因;從長(zhǎng)壽型陰道毛滴蟲細(xì)胞的消減雜交文庫中也獲得三個(gè)已知的基因(分別是:Cysteine proteina

4、se,Ribulose及actin),以及5個(gè)未知基因的序列,也可能是新基因;其余序列為重復(fù)序列。從陰道毛滴蟲細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫中成功篩選出壽命相關(guān)基因SIR2的同源基因(Tv-SIR2-like)。保守結(jié)構(gòu)域序列同源性分析顯示,Tv-Sir2p-like氨基酸序列具有Sir2p及其同源蛋白質(zhì)特征性的三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。Tv-Sir2p-like可能具有Sir2p及其同源蛋白質(zhì)使轉(zhuǎn)錄沉默的功能。Southern blot顯示,Tv-SIR

5、2-like在陰道毛滴蟲細(xì)胞內(nèi)為單拷貝基因。Northern blot結(jié)果顯示,Tv-SIR2-like mRNA大小約1,3kb。成功構(gòu)建Tv-SIR2-like原核表達(dá)重組子,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果顯示,重組子在宿主菌大腸桿菌BL21內(nèi)表達(dá)出預(yù)期大小的GST融合蛋白質(zhì)。
　　結(jié)論：采用PCR選擇性消減雜交技術(shù),構(gòu)建了模式生物陰道毛滴蟲衰老相關(guān)基因差異表達(dá)消減雜交文庫,所篩選出的基因在陰道毛滴蟲細(xì)胞壽