大麗花花瓣衰老相關(guān)基因結(jié)構(gòu)與表達特征的研究.pdf

1、花瓣衰老是植物生命周期的最后發(fā)育階段，表現(xiàn)為花瓣萎蔫或脫落、花色改變、花徑變小等特征，涉及一系列生理代謝過程，是基因表達、蛋白質(zhì)合成以及內(nèi)外因素綜合調(diào)控的結(jié)果。前人在大麗花花瓣蛋白質(zhì)組研究中已分離、鑒定了多種花瓣衰老相關(guān)的差異表達蛋白質(zhì)，主要涉及乙烯合成、花色素合成以及細胞壁修飾等生理功能，并且已克隆了2個大麗花木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶基因（DpXTH1和 DpXTH2），但對它們在轉(zhuǎn)錄水平上的表達特征還缺少研究和了解。
　　

2、本研究以大麗花‘單瓣黃’品種為試驗材料，利用基因克隆技術(shù)，克隆了大麗花花瓣衰老相關(guān)基因；應(yīng)用生物信息學(xué)方法，探討了基因結(jié)構(gòu)與進化關(guān)系；利用實時熒光定量 PCR技術(shù)，分析不同發(fā)育階段、不同外源激素處理條件下大麗花花瓣衰老相關(guān)基因的表達特征，主要實驗結(jié)果如下：
　　1.應(yīng)用分子生物學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)，從大麗花花瓣中克隆了CHS、ANS和CHI基因的cDNA序列，分別命名為DpCHS、DpANS和DpCHI。DpCHS基因的編碼區(qū)序列為

3、1170 bp，編碼389個氨基酸殘基和1個終止密碼子；DpANS基因的編碼區(qū)序列為1068 bp，編碼355個氨基酸殘基和1個終止密碼子；DpCHI基因的編碼區(qū)序列為675 bp，編碼224個氨基酸殘基和1個終止密碼子。Blast分析結(jié)果表明，DpCHS、DpANS和DpCHI均與大麗花栽培品種Michael J的同源性最高為99％。聚類分析結(jié)果表明，DpCHS、DpANS、DpCHI與已報導(dǎo)的多種菊科植物親緣關(guān)系最近，都分別聚為同一

4、組，基于氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹與植物親緣關(guān)系的進化基本一致，同科植物在進化上處于同一分支。
　　2.應(yīng)用分子生物學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)，分別以向日葵 SAMS序列（GenBank JN561248.1）和菊花ETR序列（GenBank：AF547624.1）為原始核酸序列，電子克隆了SAMS及ETR基因的cDNA編碼區(qū)序列。分別在該序列的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，從大麗花花瓣中克隆了SAMS、ETR基因的cDNA部分序列，分別命名為DpS

5、AMS和DpETR。DpSAMS基因片段大小為163 bp，編碼54個氨基酸殘基；DpETR基因片段大小為118 bp，編碼39個氨基酸殘基。Blast分析結(jié)果表明，DpSAMS在100條比對結(jié)果中同源性在83-96%之間，其中與向日葵的同源性最高為96%；DpETR在100條比對結(jié)果中同源性在71-91%之間，其中與菊花的同源性最高為91%。
　　3.從自然生長狀態(tài)下大麗花現(xiàn)蕾期、初花期、盛花期和衰敗期的花瓣中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄

6、合成cDNA，設(shè)計DpCHS、DpANS、DpCHI、DpSAMS和DpETR基因的實時定量PCR特異引物，以β-actin為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，結(jié)果表明DpCHS、DpANS和DpETR基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達量均呈先上升后下降的趨勢，即從初花期開始積累，至盛花期達到峰值，到衰敗期又下降；DpCHI的轉(zhuǎn)錄水平呈逐漸下降的趨勢，即現(xiàn)蕾期的表達量最高，隨后逐漸降低；DpSAMS的表達量呈逐漸上升的趨勢，至衰敗

7、期達到峰值。初步判定DpCHS、DpANS、DpETR和DpSAMS為大麗花花瓣衰老相關(guān)基因，而DpCHI為大麗花花瓣衰老下調(diào)基因。·
　　4.采用乙烯利（ETH）、1-甲基環(huán)丙烯（MCP）為外源激素，對大麗花初花期的花瓣進行“在體處理”，以不作任何處理為對照區(qū)，分別處理0.5h、1h、3h、6h、12 h、24 h、48 h、72 h后，提取各試驗區(qū)花瓣的RNA進行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，在處理期間內(nèi)，DpCHI、DpSA

8、MS、DpETR、DpXTH1和DpXTH2的表達量總體上均呈先上升后下降的變化趨勢；其中在對照區(qū)和 ETH處理區(qū)，DpCHS和 DpANS表達量表現(xiàn)為上升后下降，而MCP處理區(qū)呈逐漸上升趨勢；與對照區(qū)相比，在ETH處理的花瓣中，衰老相關(guān)基因的表達量較高，且較早檢測到峰值，而MCP處理則降低了表達量，且推遲了峰值出現(xiàn)的時間，說明外源乙烯和MCP處理可以調(diào)控大麗花花瓣的衰老進程，并且其調(diào)控作用與上述基因的表達變化有關(guān)。
　　5.采用

9、乙烯利（ETH）、1-甲基環(huán)丙烯（MCP）為外源激素，分別對大麗花現(xiàn)蕾期、初花期、盛花期的花瓣進行“在體處理”12 h，以不作任何處理為對照區(qū)，提取各試驗區(qū)花瓣的RNA進行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，在初花期經(jīng)ETH處理12 h后的花瓣中，檢測到DpCHS、DpANS、DpETR、DpXTH1和DpXTH2基因的表達量峰值，而DpCHI表達量峰值出現(xiàn)在現(xiàn)蕾期，DpSAMS的表達量峰值出現(xiàn)在盛花期；就不同基因而言，DpCHI的表達量峰值