順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老相關(guān)新基因的篩選及功能鑒定.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老過(guò)程中相關(guān)機(jī)制研究
　　 研究背景與目的：
　　 本研究采用順鉑這一臨床上最常用的化療藥物分別誘導(dǎo)NG108-15,Hela,A2780三株不同組織類型的腫瘤細(xì)胞系，試圖闡明相關(guān)衰老調(diào)控基因在其中所發(fā)揮的作用。
　　 方法：
　　 一、應(yīng)用不同濃度梯度順鉑作用腫瘤細(xì)胞，選擇能夠達(dá)到最高衰老率而無(wú)明顯凋亡發(fā)生的濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。
　　

2、二、運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)腫瘤細(xì)胞衰老過(guò)程中HP1-γ蛋白的表達(dá)變化；應(yīng)用SA-βGal染色法檢測(cè)順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老情況。
　　 三、采用MTT法和CFSE染色法檢測(cè)順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老過(guò)程中的細(xì)胞增殖情況；
　　 四、選用咖啡因抑制ATM基因；PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化；Western blot檢測(cè)P53、P21、CDC2等衰老相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)變化情況；
　　 結(jié)果：
　　 在一定小劑量順鉑誘導(dǎo)

3、下，NG108-15、Hela、A2780細(xì)胞均呈現(xiàn)出衰老表型。細(xì)胞變大變扁平，胞漿空泡增多，SA-βGal染色呈陽(yáng)性著色，HP1-γ蛋白表達(dá)增多并呈灶狀聚集分布在細(xì)胞核。衰老細(xì)胞增殖幾乎停滯，細(xì)胞周期主要阻滯在G2/M期。ATM抑制劑咖啡因可以抵抗順鉑誘導(dǎo)的衰老發(fā)生。P53、P21、CDC2基因在順鉑誘導(dǎo)衰老過(guò)程中表達(dá)量和活性明顯發(fā)生改變。
　　 結(jié)論：
　　 一定小劑量的順鉑可以誘導(dǎo)NG108-15、Hela、A27

4、80細(xì)胞發(fā)生加速性衰老。DNA損傷修復(fù)通路上的ATM、P53、P21、CDC2等基因參與了順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞衰老過(guò)程；抑制ATM基因表達(dá)后可以逆轉(zhuǎn)順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞衰老。
　　 第二部分：利用二維電泳技術(shù)篩選新的順鉑誘導(dǎo)衰老相關(guān)基因
　　 研究背景與目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)選取二維電泳技術(shù)作為主要研究手段，系統(tǒng)篩選分析順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老過(guò)程中相關(guān)差異表達(dá)蛋白，以期找到新的衰老相關(guān)調(diào)控基因。
　　 方法：

5、r>　　 一、以一定劑量順鉑誘導(dǎo)NG108-15細(xì)胞衰老，提取細(xì)胞總蛋白；
　　 二、采用二維電泳法篩選NG108-15細(xì)胞衰老前后表達(dá)差異蛋白。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，選取表達(dá)差異在1.5倍以上的蛋白點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析。
　　 三、MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析鑒定選取蛋白質(zhì)
　　 四、Western blot、細(xì)胞免疫熒光驗(yàn)證二維電泳篩選出的差異蛋白的表達(dá)情況；構(gòu)建裸鼠皮下瘤模型，瘤根原位注射順鉑。冰凍切片免疫組化法檢

6、測(cè)GRP78蛋白表達(dá)變化情況，SA-β-Gal染色法檢測(cè)瘤體細(xì)胞衰老情況；
　　 結(jié)果：
　　 對(duì)照SDS-PAGE膠中共有517±25個(gè)點(diǎn)被檢測(cè)出，衰老NG108-15細(xì)胞對(duì)應(yīng)的膠中共有 474±21點(diǎn)被檢測(cè)出。選取二維電泳膠中NG108-15細(xì)胞衰老前后5個(gè)表達(dá)差異明顯的蛋白點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析。MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析共檢測(cè)出5個(gè)差異蛋白。Western blot驗(yàn)證了Vimentin和GRP78在衰老前后的表達(dá)

7、變化與二維電泳結(jié)果一致。Western blot、細(xì)胞免疫熒光和荷瘤裸鼠模型均證實(shí)GRP78在順鉑誘導(dǎo)NG108-15細(xì)胞發(fā)生衰老后表達(dá)明顯降低。
　　 結(jié)論：
　　 作為高通量篩選差異蛋白的有效技術(shù)手段，二維電泳技術(shù)可被成功用于篩選新的順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老相關(guān)調(diào)控基因。GRP78蛋白在順鉑誘導(dǎo)NG108-15細(xì)胞衰老的過(guò)程中表達(dá)明顯降低，可能與順鉑誘導(dǎo)的衰老存在某種聯(lián)系。
　　 第三部分：GRP78基因在順鉑誘

8、導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老過(guò)程中的功能鑒定
　　 研究背景與目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)二維電泳等技術(shù)證明GRP78基因在順鉑誘導(dǎo)NG108-15細(xì)胞衰老過(guò)程中表達(dá)明顯降低，其可能是新的順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的相關(guān)調(diào)控基因。因此本研究擬對(duì)GRP78基因在順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老中所扮演的角色進(jìn)行深入探討，以期闡明相關(guān)調(diào)控機(jī)制，為臨床化療提供新的治療靶點(diǎn)和有效方案。
　　 方法：
　　 一、Western blot 分別檢

9、測(cè)GRP78在順鉑誘導(dǎo)NG108-15、Hela、A2780細(xì)胞衰老過(guò)程中的表達(dá)變化情況；
　　 二、SiGRP78通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，Western blot 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果并檢測(cè)相關(guān)衰老調(diào)控基因變化情況。SA-β-Gal染色檢測(cè)封閉GRP78后腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)衰老的敏感性變化情況；
　　 三、應(yīng)用GRP78誘導(dǎo)劑2DG和A23187上調(diào)GRP78在不同腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)，SA-β-Gal染色檢測(cè)上調(diào)GRP78蛋白

10、后腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)衰老的敏感性變化情況；Western blot檢測(cè)上調(diào)GRP78后順鉑誘導(dǎo)衰老過(guò)程中P53、P21等衰老相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)變化情況；
　　 四、應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度相對(duì)變化情況；
　　 五、免疫組化法檢測(cè)GRP78蛋白及HP1-γ蛋白在宮頸癌和卵巢癌中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 一、Western blot結(jié)果顯示GRP78在NG108-15、Hela、A2

11、780細(xì)胞順鉑誘導(dǎo)衰老過(guò)程中表達(dá)降低。Western blot結(jié)果顯示CASPASE7 在衰老過(guò)程中始終以無(wú)活性形式存在，提示在順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老過(guò)程中無(wú)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑激活。
　　 二、在NG108-15、Hela、A2780細(xì)胞中利用GRP78SiRNA封閉GRP78表達(dá)后，P53表達(dá)均明顯升高；
　　 三、在NG108-15、Hela和A2780細(xì)胞中利用SiRNA下調(diào)GRP78表達(dá)后細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的衰老敏感性略有

12、增加。利用SiRNA下調(diào)卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞C13K的GRP78表達(dá)后衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率明顯升高。
　　 四、2DG誘導(dǎo)GRP78表達(dá)上調(diào)后NG108-15細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)衰老的敏感性明顯降低，接著SiRNA下調(diào)GRP78表達(dá)后敏感性恢復(fù)。而在Hela和A2780細(xì)胞中則無(wú)明顯改變。在Hela和A2780細(xì)胞中A23187誘導(dǎo)GRP78表達(dá)上調(diào)后細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)衰老的敏感性顯著降低，SiRNA下調(diào)GRP78表達(dá)后敏感性恢復(fù)

13、。
　　 五、Western blot結(jié)果顯示上調(diào)GRP78表達(dá)后順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老過(guò)程中P53表達(dá)升高趨勢(shì)明顯被抑制。
　　 六、胞漿內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度檢測(cè)顯示誘導(dǎo)衰老劑量的順鉑作用NG108-15細(xì)胞24小時(shí)后胞漿內(nèi)鈣離子濃度升高，而上調(diào)GRP78后順鉑作用24小時(shí)胞漿內(nèi)鈣離子濃度無(wú)明顯升高。誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)GRP78高表達(dá)后接著用SiRNA下調(diào)GRP78表達(dá)，則順鉑作用24小時(shí)時(shí)胞漿內(nèi)鈣離子濃度顯著升高。
　　

14、七、免疫組化結(jié)果顯示GRP78在宮頸癌的正常組織以及癌前病變和原位癌中呈高表達(dá)，而在癌組織中的表達(dá)較低。GRP78在卵巢正常和良性組織中表達(dá)較低，而在卵巢癌中呈高表達(dá)。在各種腫瘤組織GRP78表達(dá)與HP1-γ表達(dá)具有高度相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 一、GRP78作為新發(fā)現(xiàn)的化療介導(dǎo)的衰老相關(guān)調(diào)控基因，與P53、P21、CDC2等DNA損傷修復(fù)基因具有一定的相互拮抗或促進(jìn)作用；下調(diào)GRP78的表達(dá)能夠顯著提高P53基因的

15、表達(dá)水平，而上調(diào)其表達(dá)則能夠顯著降低腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)衰老的敏感性。提示GRP78在順鉑誘導(dǎo)腫瘤衰老過(guò)程中主要扮演抵抗衰老的角色。
　　 二、GRP78可能通過(guò)影響DNA損傷修復(fù)通路基因的表達(dá)及胞漿內(nèi)鈣離子濃度的改變從而影響腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)衰老的敏感性。在宮頸癌癌前病變中GRP78的表達(dá)明顯高于正常組織和癌組織，且與HP1-γ蛋白的表達(dá)具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，提示其可能參與了正常細(xì)胞向癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程。在卵巢癌中GRP78呈高表

16、達(dá)，提示其可能通過(guò)抗衰老途徑影響卵巢癌化療效果。
　　 第四部分：應(yīng)用激光掃描細(xì)胞儀分析GRP78蛋白和HP1-γ蛋白在食管癌各級(jí)病變中的表達(dá)情況及兩者表達(dá)相關(guān)性的研究
　　 研究背景和目的：
　　 本文以包含食管癌各級(jí)病變標(biāo)本的組織芯片作為研究對(duì)象，通過(guò)激光掃描細(xì)胞儀掃描分析GRP78蛋白和HP1-γ蛋白的免疫組化結(jié)果，初步探討GRP78蛋白和HP1-γ蛋白在食管癌惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的表達(dá)及相關(guān)關(guān)聯(lián)情況。
　

17、　 方法：
　　 選用含各級(jí)別食管癌病變組織的組織芯片，采用免疫組化方法檢測(cè)其中的GRP78蛋白和HP1-γ蛋白的表達(dá)，并通過(guò)激光掃描細(xì)胞儀對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行定量分析。GRP78蛋白和HP1-γ蛋白的表達(dá)相關(guān)性采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 激光掃描細(xì)胞儀掃描整張組織芯片后獲得選定組織區(qū)域的虛擬圖及陽(yáng)性像素點(diǎn)百分比；正常食管組織、中-重度異型增生、原位癌、食管鱗癌的GRP78陽(yáng)性率分別為0%，90.

18、4%、83.3%和47.4%。GRP78在正常食管、中-重度異型增生加原位癌、食管鱗癌三組中的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。HP1-γ蛋白主要在胞核表達(dá)。HP1-γ蛋白在正常食管組織、中-重度異型增生、原位癌、食管鱗癌的陽(yáng)性率分別為37.5%，100%、100%和23.7%。HP1-γ在正常食管、中-重度異型增生加原位癌、食管鱗癌這三組組織中表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。GRP78蛋白和HP1-γ蛋白的表達(dá)具有高度相關(guān)性。
　　 結(jié)