人臍帶間充質(zhì)干細胞干預衰老相關(guān)認知功能下降的作用及機制研究.pdf

1、衰老是一種多因素、多器官參與的綜合性現(xiàn)象。當個體成熟并隨著年齡增長，機體在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能等方面會出現(xiàn)一系列的退行性變化，而腦是受衰老影響最大的器官之一[1,2]。
　　腦衰老分為生理性變化與病理性變化，前者引起的認知能力減退的現(xiàn)象被定義為衰老性認知(Cognitive aging)[3,4]，其并不被認為是疾病狀態(tài)，后者與阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關(guān)。腦衰老在早期表現(xiàn)為與

2、年齡和教育程度相對的學習記憶能力或者其它腦功能的減退，并且逐漸發(fā)展為學習記憶能力下降、執(zhí)行功能障礙和行為改變等全面性癡呆[5]。
　　生理性腦衰老沒有發(fā)生大量神經(jīng)元凋亡的現(xiàn)象[3,6]，主要表現(xiàn)樹突棘密度的降低，突觸數(shù)量的減少，突觸后膜致密物PSD(Post-synaptic density)的變薄，突觸可塑性以及神經(jīng)發(fā)生能力的下降，這些被當作是衰老時學習記憶等認知能力下降的重要原因[7-11]。阿爾茨海默病(AD)是一種進行性神

3、經(jīng)退行性疾病，以進行性記憶力減退和獲得性知識喪失、直至完全喪失日常生活活動能力為特征；其兩大病理特征是Aβ沉積形成老年斑(Senile plaque,SP)和Tau蛋白纏結(jié)形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles, NFTs)，另外還有神經(jīng)退行性疾病的共有特征，即大量神經(jīng)元的凋亡[12]。
　　國際阿爾茨海默病協(xié)會(Alzheimer's Disease International,ADI)2016年公布

4、的數(shù)據(jù)，隨著人類壽命的延長，與衰老相關(guān)的認知功能障礙的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢[13]。腦衰老伴隨衰老性認知等多種改變，會引起老人生活質(zhì)量的下降，帶來巨大的家庭、社會負擔；甚至進展為AD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病，帶來更為嚴重的后果，成為嚴重的社會和醫(yī)療衛(wèi)生問題。目前，對衰老相關(guān)認知功能障礙的治療以緩解相關(guān)癥狀的藥物、認知訓練、健康的生活方式和飲食療法為主[14]，但干預治療效果均十分有限。
　　腦的衰老會引起大腦內(nèi)微環(huán)境的改變，進而抑制

5、神經(jīng)發(fā)生能力，破壞神經(jīng)網(wǎng)絡原有平衡，引起記憶力下降等一系列功能改變[15,16]。近期的研究表明，通過年輕血液的循環(huán)灌注可有效改善年老實驗動物骨骼肌、肝臟、脊髓和腦等多種組織器官內(nèi)干細胞[17,18]的功能狀態(tài)，推測年輕個體來源的血液可能通過某些“年輕”活性因子發(fā)揮作用，通過系統(tǒng)性調(diào)節(jié)，從而延緩和逆轉(zhuǎn)年老個體的衰老相關(guān)病變。盡管這種說法仍有待進一步考證，但這提示我們，可以利用某些“年輕”因子的干預，通過系統(tǒng)性調(diào)節(jié)衰老個體的神經(jīng)系統(tǒng)，同時

6、激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞，有可能成為有效改善和逆轉(zhuǎn)腦衰老帶來的認知性障礙的新策略。有研究表明，通過間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植可以有效的修復骨、心臟、肺臟等多種組織器官[19-21]。間充質(zhì)干細胞發(fā)揮其治療作用的方式包括分化替代和通過強大的分泌作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、改善微環(huán)境、促血管新生、抑制凋亡、營養(yǎng)支持等[22,23]。而在眾多間充質(zhì)干細胞中，人臍帶間充質(zhì)干細胞(Human umbilical

7、cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)作為醫(yī)療廢棄物，更加容易獲取、無論理學爭議，更重要的是其免疫原性更低、處于更早的生命周期、易分離純化[24]，這些使它成為臨床細胞治療更理想的種子細胞[25]。
　　在此基礎(chǔ)上，我們提出假設：hUC-MSCs作為“年輕”干細胞，在特定條件下能夠分泌大量具有多重功能的細胞調(diào)節(jié)因子等活性物質(zhì)，通過系統(tǒng)性調(diào)節(jié)，可能對改善衰老大腦的生理或病例狀態(tài)具有重要的作用。

8、r>　　為了驗證我們提出的假說，將分為兩個部分開展相關(guān)作用和機制的探索—hUC-MSCs干預衰老性認知的作用及其機制，以及 hUC-MSCs治療阿爾茨海默病的作用及其機制。我們分別選用D-半乳糖(D-galactose)致衰老小鼠作為研究衰老性認知的模型，SAMP8小鼠(Senescence-accelerated mouse/prone8)作為研究阿爾茨海默病的模型。
　　研究表明，小鼠等嚙齒類動物長期皮下注射高劑量 D-半乳糖

9、，會引起機體代謝紊亂，進而加速其臟器尤其是腦的退行性變化，類似于自然衰老的表現(xiàn)[26]，主要體現(xiàn)在細胞轉(zhuǎn)錄水平降低[27]和海馬區(qū)神經(jīng)再生障礙[28-30]等衰老改變。所以，在本研究中，我們選擇D-半乳糖致衰老小鼠模型作為研究衰老性認知的動物模型。
　　另外，SAMP8小鼠顯示了許多阿爾茨海默病所具有的特性，如行為紊亂、記憶力下降、β淀粉樣蛋白沉積和tau蛋白磷酸化等，它以早期發(fā)生快速老化且伴隨顯著的學習記憶能力障礙為特征，且隨增

10、齡而加重[31-33]。SAMP8是自然篩選得到的疾病模型，它的發(fā)育和成長，更加符合自然狀態(tài)下，從腦衰老進展為阿爾茨海默病的過程。因此，在本研究中，我們選擇SAMP8小鼠作為研究阿爾茨海默病的動物模型。
　　由于MSCs直徑大、粘附力強的原因，在小鼠等多個物種上靜脈注射MSCs會引起不同程度肺不張和肺栓塞[34,35]。而有研究稱，通過腹腔注射間充質(zhì)干細胞可以改善小鼠肌肉狀態(tài)、延長小鼠壽命[36]和改善小鼠腦白質(zhì)營養(yǎng)不良[37]。

11、這為我們選擇腹腔移植的方式，來研究 hUC-MSCs是否可以通過分泌途徑改善衰老模型鼠和AD模型鼠的認知能力提供了依據(jù)。
　　我們知道，在人類和小鼠的衰老過程中，大腦海馬極易受損，主要表現(xiàn)為神經(jīng)發(fā)生能力下降、突觸可塑性相關(guān)基因下調(diào)表達、新生神經(jīng)元減少、樹突棘密度降低，并帶來相應的突觸可塑性降低和認知功能下降[38,39]。所以，以上指標是我們評判 hUC-MSCs干預衰老相關(guān)認知功能障礙的主要指標。另外，海馬區(qū)是調(diào)節(jié)情景記憶和空間

12、記憶的主要腦區(qū)[40]，在認知功能的評價上我們采用了評價空間學習記憶能力和情景記憶的相關(guān)行為學實驗：Morris水迷宮、Y迷宮、新物體識別、穿梭箱和條件恐懼實驗等。
　　首先，在衰老性認知模型鼠的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在建模后，模型鼠發(fā)生了一系列的腦衰老特征的改變：空間學習記憶功能的下降；CA1（Cornu ammonis1,安蒙氏角1）突觸可塑性下降，CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的樹突棘密度明顯降低；超微結(jié)構(gòu)顯示，在海馬CA1和DG（Denta

13、te gyrus，齒狀回），興奮性突觸的突觸后膜致密物變薄，神經(jīng)元的微絲微管排列紊亂，髓鞘水腫分解，線粒體結(jié)構(gòu)破壞；海馬體內(nèi)，興奮性突觸后膜致密物的主要成分PSD-95表達下降。hUC-MSCs移植后，上述腦衰老的特征得到了明顯的改善。同時，hUC-MSCs能夠通過激活模型鼠大腦中內(nèi)源性神經(jīng)干/祖細胞，從而促進了大腦的神經(jīng)發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，移植的hUC-MSCs能夠通過激活模型鼠大腦海馬內(nèi)ERK-CREB途徑，從而發(fā)揮其干預作用。<

14、br>　　其次，在AD模型鼠實驗中，hUC-MSCs改善了包括對環(huán)境適應能力、探索活力、條件記憶能力、對已知事物的記憶識別能力和空間定位的能力在內(nèi)的認知能力。并且，hUC-MSCs治療小鼠的海馬和皮層內(nèi)，包括P-tau（S396）、GSK-3β、BACE1、APP在內(nèi)的AD相關(guān)蛋白的表達量得到下調(diào)，且其皮層和海馬內(nèi)神經(jīng)干細胞標志 Nestin表達量上調(diào)。進一步，通過高通量篩選、生物信息學分析和多個AD細胞模型，篩選出關(guān)鍵的作用因子HGF

15、，并且在AD模型鼠上確認了HGF的治療作用。通過體外模型證實，hUC-MSCs能夠通過HGF/c-Met系統(tǒng)介導，激活AKT通路，進一步抑制GSK-3β的活性，從而下調(diào)Tau蛋白的磷酸化水平，最終修復受損的神經(jīng)細胞。
　　綜上，兩部分結(jié)果表明，一方面 hUC-MSCs能夠通過分泌途徑在生理性腦衰老方面進行系統(tǒng)性的干預和改善衰老小鼠腦衰老性特征；另一方面，針對病理性腦衰老的典型疾病狀態(tài)阿爾茨海默病，hUC-MSCs能夠明顯改善AD模