人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠腹膜纖維化的修復(fù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的改變，我國慢性腎臟?。–KD）的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，CKD大多起病隱匿，且目前尚缺乏早期診斷和治療方法，部分患者將進(jìn)展至終末期腎臟疾?。‥SRD）。腹膜透析（PD）是ESRD的主要替代治療方法之一。然而，腹膜長期暴露于非生理性的腹膜透析液會造成腹膜間皮細(xì)胞（PMCs）層損傷、脫落、表型改變、新血管生成增加、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和炎細(xì)胞浸潤，最終導(dǎo)致腹膜纖維化（PF）。PF迄今仍然是一個世界性的難題,尚缺乏

2、有效的防治對策，治療上主要以預(yù)防為主，是導(dǎo)致ESRD患者被迫中斷長期腹膜透析的最主要因素,制約了腹膜透析的應(yīng)用和發(fā)展。因此,如何延緩、阻斷PF進(jìn)程，已成為本研究領(lǐng)域的一個亟待解決的重要問題。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下，可修復(fù)器官的損傷及治療器官纖維化。本實驗室旨在建立穩(wěn)定的、標(biāo)準(zhǔn)化的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）體外培養(yǎng)方法，并且在能夠保證hUC-MSCs長期培養(yǎng)的

3、基礎(chǔ)上，用于PF的修復(fù)研究并對修復(fù)機(jī)制進(jìn)行探討，為hUC-MSCs治療PD相關(guān)PF奠定理論基礎(chǔ)，為干細(xì)胞在腎臟病領(lǐng)域的應(yīng)用開拓積累經(jīng)驗。
　　對象與方法：取新鮮臍帶組織，以組織貼塊法對臍帶中的hUC-MSCs進(jìn)行分離、培養(yǎng)、傳代，并誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化，以流式細(xì)胞儀鑒定所分離的細(xì)胞為hUC-MSCs。以甲基乙二醛（MGO）加入2.5％腹膜透析液配置成20mmol/L的混合液，按照10ml/天連續(xù)2周腹腔注射上述混合液復(fù)制

4、大鼠PF模型。以2×106個hUC-MSCs沿大鼠尾靜脈緩慢一次性推入，對PF進(jìn)行干預(yù)。2周后，進(jìn)行腹膜功能評價，收集腹膜組織進(jìn)行HE、天狼星紅染色，免疫組化觀察BMP-7、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA、Snail1蛋白在腹膜組織的表達(dá)變化。對大鼠腹膜間皮細(xì)胞（RPMCs）進(jìn)行原代培養(yǎng)、鑒定，以2.5 ng/ml TGF-β1處理間皮細(xì)胞，并用hUC-MSCs及hUC-MSCs條件培養(yǎng)基（ hUC-MSCs-CM）進(jìn)行

5、干預(yù)， Western Blot方法檢測E-cadherin、α-SMA、pSmad2的蛋白表達(dá)變化，探討TGF-β1/Smad2通路在hUC-MSCs修復(fù)PF過程中所起的作用。
　　結(jié)果：本實驗以組織貼塊法成功分離、培養(yǎng)了hUC-MSCs。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD105、CD90高表達(dá),分別為98.32%和99.19%，鑒定為hUC-MSCs。MGO對Wistar大鼠腹腔注射兩周后，免疫組化分析顯示，腹膜組織Snail1

6、、TGF-β1、α-SMA表達(dá)明顯上調(diào)，BMP-7、E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)，經(jīng)尾靜脈注射hUC-MSCs的大鼠， Snail1、TGF-β1、α-SMA表達(dá)明顯下調(diào)，BMP-7、E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)。以TGF-β1刺激RPMCs后，發(fā)現(xiàn)α-SMA、pSmad2的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，E-cadherin明顯下調(diào)， hUC-MSCs及hUC-MSCs-CM進(jìn)行干預(yù)后，α-SMA、pSmad2的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，E-cad

7、herin明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：我們利用組織貼塊法自正常產(chǎn)婦臍帶中成功分離出了hUC-MSCs。hUC-MSCs可以抑制MGO誘導(dǎo)的大鼠PF的發(fā)生，此作用可能是通過下調(diào)BMP-7，改善腹膜組織PMCs的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）實現(xiàn)的。體外實驗，hUC-MSCs及hUC-MSCs-CM可以有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的RPMCs的EMT，此作用是hUC-MSCs通過旁分泌機(jī)制抑制RPMCs TGF-β1/Smad2信號通路活性實現(xiàn)的。