人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血作用研究.pdf

1、目的:將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells,hUMSCs)移植到大鼠腦出血模型,觀察移植細(xì)胞在大鼠出血損傷腦組織中的存活、遷徙和神經(jīng)分化情況,探討hUMSCs移植對(duì)大鼠腦出血后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響及其作用機(jī)制,為hUMSCs在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:無菌條件下收集足月妊娠剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,D-Hank’s洗去血管內(nèi)的殘存血,剔

2、除臍帶動(dòng)靜脈,將剩余的組織剪碎至1mm3大小的組織塊,0.2％膠原酶Ⅱ消化,在含有20%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、2ng/ml表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)、25mM左旋谷氨酰胺(L-glutamine,L-Glu)、100 U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)。觀察原代培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,當(dāng)細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)時(shí),加入0.2

3、5%胰酶-1 mM EDTA消化細(xì)胞,并傳代。
　　 收集消化后的細(xì)胞,以流式細(xì)胞法行細(xì)胞表型檢測,包括PE-CD11b,PE-CD45,PE-CD73,PE-CD90,PE-CD105,PE-HLA-DR(HLA-Ⅱ),FITC-CD19,和FITC-CD34并以FITC或PE標(biāo)記的小鼠IgG1作為同型對(duì)照。
　　 選取體重在270-300 g之間的成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,根據(jù)包新民《大鼠腦立

4、體定位圖譜》定位,用直徑1mm的牙科鉆頭在大鼠右側(cè)顱骨(AP=-0.5 mm;ML=3.0 mm)鉆孔,將微量注射器固定在立體定向架上,取膠原酶Ⅶ水溶液2 u1,以前囟為參照點(diǎn)緩慢注射到右側(cè)尾狀核頭部(AP=-0.5 mm;ML=3.0 mm;DV=5.5 mm),建立大鼠腦出血模型(intracerebral hemorrhage,ICH)。腦出血模型建立成功后24 h,采用改良神經(jīng)功能缺失評(píng)分(modified neurologic

5、al severity score,mNSS)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià),選取評(píng)分在7-12分間(中度損傷)大鼠納入實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為三組:(1)hUMSCs移植組,n=20;(2)磷酸鹽緩沖液(PhosphateBuffered Saline,PBS)對(duì)照組,n=20;(3)假手術(shù)組(sham組),n=5。
　　 將大鼠再次麻醉,頭部固定于立體定向架上。用10μL的Hamilton注射器,將1,1’-雙十八烷-3,3,3’,3-

6、四甲基吲哚羰花青-高氯酸鹽(1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)標(biāo)記的hUMSCs緩慢注射到hUMSCs組大鼠的右側(cè)出血灶區(qū)域邊緣(AP=-0.5mm ML=3.0 mm DV=3.5 mm)。每只大鼠接受10μL注射,共2×105細(xì)胞。拔針后用醫(yī)用生物蛋白膠將注射針孔及骨孔封閉。PBS對(duì)照組依同樣方法注入等量的PBS替代hUMSC

7、s。
　　 細(xì)胞移植后1、7、14、21、28、35 d對(duì)所有大鼠進(jìn)行mNSS評(píng)分;將大鼠處死迅速斷頭取出全腦連續(xù)冰凍切片,免疫熒光染色檢測DiI標(biāo)記hUMSCs在出血腦組織中存活、遷徙以及成熟神經(jīng)元標(biāo)志-微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein2,MAP2)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志-膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達(dá)情況。采用SPSS

8、15.0for Windows統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:細(xì)胞培養(yǎng)第2 d即可見有少量形態(tài)各異的貼壁細(xì)胞,散在分布。1W左右時(shí),貼壁細(xì)胞形成集落,以后見成纖維細(xì)胞樣克隆形成,克隆呈放射狀生長。在培養(yǎng)2 W,細(xì)胞接近90%匯合時(shí),經(jīng)消化后按1:2的比例將細(xì)胞傳代。傳代后數(shù)小時(shí)內(nèi)可見其迅速貼壁,1 W左右達(dá)到90%～95%匯合程度,低倍鏡下細(xì)胞呈排列緊密的漩渦樣結(jié)構(gòu)。
　　 流式細(xì)胞檢測顯示這些細(xì)胞均一地

9、高表達(dá)MSCs標(biāo)志CD73、CD90、CD105。不表達(dá)造血系標(biāo)志CD34、CD45,中性粒細(xì)胞標(biāo)志CD11b,人B細(xì)胞標(biāo)志CD19。對(duì)組織相容性免疫表型的分析顯示hUMSCs不表達(dá)人白細(xì)胞抗原HLA-DR(HLA-Ⅱ)。
　　 細(xì)胞移植后24 h,huMSCs移植組、PBS對(duì)照組大鼠的mNSS評(píng)分之間沒有顯著性差異(P＞0.05),但與假手術(shù)組比較,均存在顯著性差異(P＜0.05)。細(xì)胞移植后7～35 d,hUMSCs組和PB

10、S對(duì)照組動(dòng)物的mNSS評(píng)分均有不同程度分值下降,但hUMSCs組較PBS組下降更為明顯(p＜0.05)。hUMSCs移植組大鼠在肌力、反應(yīng)力、平衡感以及反射等各個(gè)方面較PBS組改善更為顯著。雖然,hUMSCs移植組不同程度降低了腦出血后神經(jīng)功能評(píng)分,但部分指標(biāo)與假手術(shù)組相比,仍有明顯差異(p＜0.05)。
　　 免疫熒光染色證明,hUMSCs移植后35 d可以有一定數(shù)量的hUMSCs在宿主腦內(nèi)存活,除了部分細(xì)胞聚集存在于注射區(qū)及

11、針道內(nèi)外,絕大多數(shù)移植細(xì)胞分布在出血損傷區(qū)周圍。此外,移植組的對(duì)側(cè)大腦也發(fā)現(xiàn)了少量移植細(xì)胞。在熒光顯微鏡下還發(fā)現(xiàn),部分hUMSCs遷移插入到血管結(jié)構(gòu)當(dāng)中并沿血管走向方向排列,圍成管狀的紅色熒光結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色證實(shí)其中的部分移植細(xì)胞可以表達(dá)MAP2、GFAP。但值得注意的是:這些表達(dá)MAP2或GFAP的移植細(xì)胞并不具有典型的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。
　　 結(jié)論:本研究證實(shí)了人臍帶富含MSCs,可在體外進(jìn)行分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增傳代。并