左歸丸聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植防治大鼠宮腔粘連的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察輕、中度宮腔粘連患者血清中TNF-α、IL-1及IL-6等促炎因子的表達(dá)，探討炎癥反應(yīng)在宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA）發(fā)病機(jī)制中作用；在成功建立大鼠IUA模型的基礎(chǔ)上，觀察左歸丸及人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)IUA模型大鼠的宮腔纖維化是否具有改善作用，并從免疫調(diào)節(jié)方面初步探討其可能機(jī)制。
　　方法：第一部分臨床研究，選取已確診輕、中度宮腔粘連患者30例及同期因繼發(fā)不孕行宮腔鏡檢查且子宮內(nèi)膜正

2、常的患者30例，確診后無(wú)菌采血約3ml，離心后取上清。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定兩組患者血清中TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)水平。
　　第二部分動(dòng)物造模，48只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組12只。A假手術(shù)組：僅開(kāi)腹穿刺左側(cè)子宮，無(wú)熱水損傷；B熱損傷10s組：導(dǎo)管穿刺左側(cè)宮腔，連接100℃沸騰熱水損傷10s；C熱損傷15s組；D熱損傷20s組。分別于造模后第3d、7d、14d、21d處死各組大鼠3只，收集雙側(cè)子宮。HE染色

3、觀察各組大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化及子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目改變；asson染色觀察各組大鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維化情況，并利用 IPP圖像分析軟件分析各組子宮內(nèi)膜纖維化面積比。
　　第三部分實(shí)驗(yàn)研究，30只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只。A假手術(shù)組：僅穿刺左側(cè)中段子宮，不予熱損傷，不予任何干預(yù)；B模型組：造模后不予其他干預(yù)；C藥物組：造模后給予左歸丸灌胃；D人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal st

4、em cell，hUC-MSC）移植組：造模后尾靜脈注射P3代hUC-MSCs；E聯(lián)合組：造模后給與左歸丸+hUC-MSC移植。治療28d后處死各組大鼠，取雙側(cè)子宮，同時(shí)采集心臟血3ml。HE染色和Masson染色觀察各組大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化、內(nèi)膜腺體數(shù)目及子宮內(nèi)膜纖維化面積；ELISA檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)水平；免疫熒光雙重染色法觀察子宮內(nèi)膜中CD29及 P38MAPK的定位及表達(dá)；Western blot檢

5、測(cè)子宮內(nèi)膜組織中TGF-β1、P38MAPK、P65NF-kB蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：第一部分臨床研究，與正常對(duì)照組相比，IUA患者血清中TNF-α、IL-1、IL-6呈高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　第二部分動(dòng)物造模，形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，A組宮腔呈星型，子宮內(nèi)膜完整，腺體豐富，結(jié)構(gòu)規(guī)則；B、C、D三組子宮內(nèi)膜呈不同程度損傷，其中B組在損傷后14d及21d宮腔形態(tài)已基本恢復(fù)，可見(jiàn)少量新生腺體，無(wú)明顯纖維化改

6、變；C組在損傷后14d及21d宮腔狹小，肌層完整，間質(zhì)纖維化，大量膠原纖維聚集，呈纖維樣改變，可見(jiàn)少量腺體結(jié)構(gòu)；D組子宮內(nèi)膜過(guò)度損傷，肌層紊亂結(jié)構(gòu)模糊，在損傷后7d、14d及21d宮腔完全封閉，瘢痕修復(fù)。綜合各組結(jié)果顯示，根據(jù)建模后14d子宮內(nèi)膜的形態(tài)及纖維化情況可判斷及鑒定是否成功建立IUA模型。
　　第三部分實(shí)驗(yàn)研究，①形態(tài)學(xué)觀察，與B組相比，3個(gè)治療組宮腔形態(tài)均不同程度恢復(fù)，腺體數(shù)目增加，纖維化面積減少，其中D、E兩組的腺體

7、數(shù)目增加最明顯，纖維化面積減少最明顯（P＜0.05），但對(duì)比A組，宮腔形態(tài)仍未完全恢復(fù)（P＜0.05）；②血清炎性因子表達(dá)，與B模型組相比，3個(gè)治療組大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)均顯著減少（P＜0.05）；其中D、E兩組減少最明顯（P＜0.05），但仍高于A組（P＜0.05）；③免疫熒光雙重染色，CD29陽(yáng)性細(xì)胞顯色為紅色熒光，P38MAPK陽(yáng)性顯色為綠色熒光， A、B、C三組 CD29的光密度相互比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P

8、＞0.05），D、E兩組的CD29表達(dá)明顯高于A、B、C三組（P＜0.05），其中D hUC-MSC移植組CD29陽(yáng)性表達(dá)最高（P＜0.05）；P38MAPK的表達(dá)在 B模型組最高，在3個(gè)治療組中均不同程度降低（P＜0.05），其中D、E兩組P38MAPK表達(dá)降低最明顯（P＜0.05），但仍高于A組（P＜0.05），D與E比較，P38MAPK表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；④Western blot檢測(cè)，B模型組 TGF-β1、P38

9、MAPK、P65NF-kB蛋白的表達(dá)最高（P＜0.05），3個(gè)治療組均不同程度降低（P＜0.05），其中D、E兩組降低最明顯（P＜0.05），但仍高于A組（P＜0.05），D組TGF-β1的表達(dá)低于E組（P＜0.05），高于A組（P＜0.05），D、E兩組中P38MAPK、P65NF-kB蛋白的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：⑴宮腔粘連患者血清中炎性因子TNF-α、IL-1及IL-6呈高表達(dá)；炎性因子TNF-α、IL