左歸丸聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)受損子宮內(nèi)膜的研究.pdf

1、第一部分薄型子宮內(nèi)膜PI3K、AKT mRNA的表達(dá)
　　目的：觀察薄型子宮內(nèi)膜組織中磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt/PKB) mRNA含量的表達(dá)情況，探討PI3K/AKT信號通路在薄型子宮內(nèi)膜中的作用。
　　方法：通過收集正常子宮內(nèi)膜30例及薄型子宮內(nèi)膜30例，正常子宮內(nèi)膜及薄型子宮內(nèi)膜的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文

2、獻(xiàn)，宮腔鏡手術(shù)術(shù)中收集子宮內(nèi)膜組織-70℃保存?zhèn)溆谩?br>　　結(jié)果：PI3K、AKT mRNA在薄型子宮內(nèi)膜組的表達(dá)明顯低于正常子宮內(nèi)膜組，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：PI3K/AKT信號通路存在于正常和薄型子宮內(nèi)膜組織中，且在薄型子宮內(nèi)膜增殖期PI3K、AKT表達(dá)下降，推測PI3K/AKT信號通路可能參與子宮內(nèi)膜組織的增殖、分化。
　　第二部分左歸丸聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)受損子宮內(nèi)膜的實驗研究

3、r>　　目的左：歸丸是明代醫(yī)家張景岳的滋陰補腎代表方，該方有滋陰補腎、填精益髓等功效，能調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-靶腺軸功能紊亂，臨床上廣泛用于婦科疾病、骨骼疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的治療。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)，是成體干細(xì)胞的新生代表，具有強大的自我增殖能力和多向分化潛能，且來源廣泛、不涉及倫理問題，可成為治療難治性子宮內(nèi)膜損傷疾病的種子細(xì)胞。研究證明PI3K

4、/AKT信號通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移等多種生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)過程中，起著關(guān)鍵的信號分子作用，PI3K/AKT信號通路在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜異位癥中表達(dá)活躍，可能參與介導(dǎo)了子宮內(nèi)膜的增長、修復(fù)過程。本實驗通過構(gòu)建大鼠的子宮內(nèi)膜損傷模型，探討中藥左歸丸及人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對受損子宮內(nèi)膜的修復(fù)作用。研究左歸丸及人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)受損子宮內(nèi)膜的可能作用機制，為臨床上治療子宮內(nèi)膜受損疾病提供理論依據(jù)。
　　方法：目前尚無子宮內(nèi)膜

5、受損模型的統(tǒng)一建模標(biāo)準(zhǔn)，故參照已有文獻(xiàn)，采用100℃熱水燙傷子宮內(nèi)膜方法建立SD大鼠子宮內(nèi)膜受損模型，根據(jù)摸索實驗結(jié)果，確定子宮內(nèi)膜受損模型最佳熱水燙傷時間。所有造模組均燙傷SD大鼠Y型子宮左側(cè)部分，共分5組，每組6只大鼠。A組：假手術(shù)組，即暴露 Y型子宮后，用頭皮針導(dǎo)管穿過左側(cè)子宮，后拔掉導(dǎo)管，不用流動的熱水經(jīng)過宮腔；B組：模型組，在大鼠造模完成后常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理；C組：藥物組,造模完成后第3天開始左歸丸溶液灌胃，按1.62g/

6、Kg的劑量每日灌胃一次，連續(xù)灌胃28天；D組：宮腔注射組，造模完成后第三天再開腹，經(jīng)宮腔原位注射5×107個人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；E組：聯(lián)合組，造模完成后第三天經(jīng)宮腔原位注射5×107個人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并于同一天開始左歸丸水溶液灌胃，按1.62g/Kg劑量每日一次,連續(xù)灌胃28天；治療28天后處死各組大鼠，取出每只SD大鼠Y型子宮左側(cè)造模部分，棄去靠近卵巢及陰道部分，剪成2段，一段子宮內(nèi)膜組織作HE染色、天狼猩紅染色及免疫熒光檢測，另

7、一部分子宮內(nèi)膜組織作Western Blot檢測PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.HE染色結(jié)果：與模型組比較，中藥組、宮腔注射組、聯(lián)合組子宮內(nèi)膜厚度均有不同程度增厚、腺體個數(shù)不同程度增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中宮腔注射組與聯(lián)合組的內(nèi)膜厚度及腺體個數(shù)增加最顯著（P<0.05），但與假手術(shù)組比較，宮腔形態(tài)仍未完全恢復(fù)（P<0.05）。天狼猩紅染色結(jié)果：與模型組比較，中藥組、宮腔注射組、聯(lián)合組子宮內(nèi)膜纖維化程度均

8、不同程度減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中宮腔注射組及聯(lián)合組纖維化的程度減輕最明顯；與假手術(shù)組比較，纖維化程度仍沒有完全接近，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.免疫熒光結(jié)果顯示：標(biāo)記臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的CD29紅色熒光主要集中在SD大鼠子宮內(nèi)膜的間質(zhì)部，少部分出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜靠近腺上皮及腔上皮處。標(biāo)記CD29紅色熒光主要出現(xiàn)在宮腔注射組及聯(lián)合組，但是在宮腔注射組及聯(lián)合組CD29熒光強度比較，差異不顯著（P>0.05

9、）；假手術(shù)組、模型組、中藥組子宮內(nèi)膜組織中可見少量標(biāo)記CD29的紅色熒光，三組之間相互比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。標(biāo)記AKT的綠色熒光主要集中在子宮內(nèi)膜腔上皮處及腺上皮處，少量分散在子宮內(nèi)膜間質(zhì)部。標(biāo)記AKT的熒光強度在中藥組、宮腔注射組、聯(lián)合組較假手術(shù)組及模型組均增強，且在宮腔注射組及聯(lián)合組比中藥組增強明顯，但宮腔注射組及聯(lián)合組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3．Western Blot結(jié)果顯示PI3K、AKT、p-AKT

10、蛋白在中藥組、宮腔注射組、聯(lián)合組較假手術(shù)組及模型組均不同程度增強，且宮腔注射組及聯(lián)合組的表達(dá)較中藥組均增強，但宮腔注射組與聯(lián)合組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：中藥左歸丸、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對受損子宮內(nèi)膜均有一定程度的修復(fù)作用，可以增加子宮內(nèi)膜厚度、腺體個數(shù)及抑制子宮內(nèi)膜纖維化的趨勢。經(jīng)宮腔原位注射的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在經(jīng)過治療28天后仍有部分存在于子宮內(nèi)膜中。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及左歸丸修復(fù)受損子宮內(nèi)膜可能跟激活信號通路PI3K/A