左歸丸、右歸丸對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化及osterix、oc基因表達的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:研究中醫(yī)經(jīng)典補腎方“左、右歸丸”含藥血清對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)在不同時間成骨分化的影響,通過在顯微電鏡下進行細胞形態(tài)學觀察、流式細胞鑒定(FCM)、實時熒光定量(PCR)、甲基化特異性PCR(MSP)等核心實驗技術,觀察出補腎方劑左歸丸、右歸丸含藥血清7d時間對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨分化的影響、成骨基因Osterix(成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子)和oc(骨鈣素基因)表達及甲基化的水平。從實驗的角度證明補腎

2、經(jīng)典方劑“左、右歸丸”的補腎作用,為中藥及成方提供科學的實驗研究。
  方法:以3周齡(40g±5g)的SD大鼠雙后肢骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)為實驗對象。在無菌條件下進行SD大鼠股骨及脛骨的切取并提取骨髓,進行SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的分離培養(yǎng)、傳代、純化,在通過CD29、CD34、CD45、CD90等抗體進行流式細胞鑒定(FCM);選擇12周齡的SD大鼠為實驗對象,按原方劑標準量熬制左歸丸、右歸丸藥液,按人和

3、動物體表面積折算的等效劑量每日兩次喂養(yǎng)SD大鼠連續(xù)3d,抽取其腹主動脈血液后離心制備左歸丸、右歸丸含藥血清;實驗分為兩個觀察組:實驗1組:正常對照組、左歸丸含藥血清組、成骨誘導液組;實驗2組:正常對照組、右歸丸含藥血清組、成骨誘導液組;用osterix和oc為靶基因,檢測7d后的基因表達和其甲基化水平的變化規(guī)律。應用Real time RT-PCR檢測osterix、oc成骨基因的表達情況。采用甲基化特異性PCR法檢測osterix、o

4、c基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)。
  結果:(1)通過流式細胞鑒定(FCM)技術對體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)進行檢測,體外培養(yǎng)的細胞符合骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)特性,證明了所研究的細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)。(2)在成骨誘導環(huán)境中,含藥血清干預7天后,經(jīng)Real time RT-PCR檢測,結果為:實驗A組:左歸丸組誘導osterix基因的表達明顯高于正常對照組、成骨誘導液組,組間比較差異明顯(P<0

5、.05)。左歸丸組誘導的OC基因的表達明顯高于正常對照組、成骨誘導液組,組間比較差異明顯(P<0.05)。實驗B組:右歸丸組誘導osterix基因的表達明顯高于正常對照組、成骨誘導液組,組間比較差異明顯(P<0.05)。右歸丸組誘導的OC基因的表達明顯高于正常對照組、成骨誘導液組,組間比較差異明顯(P<0.05)。(3)在成骨誘導環(huán)境中,含藥血清干預7天后,經(jīng)甲基化特異性PCR檢測,結果為:左歸丸組、右歸丸組osterix基因甲基化率明

6、顯低于成骨誘導液組、實驗對照組,組間比較差異明顯(P<0.05)。osterix基因甲基化程度依次為右歸丸組<左歸丸組<成骨誘導液組<正常對照組。左歸丸組、右歸丸組OC基因甲基化率明顯低于成骨誘導液組、實驗對照組,組間比較差異明顯(P<0.05)。OC基因啟動子區(qū)域甲基化程度依次為左歸丸組<右歸丸組<成骨誘導液組<正常對照組。
  結論:(1)采用貼壁篩選法進行體外分離、純化、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞是切實可行的,將可形成一套完整的體

7、系。(2)補腎經(jīng)典方“左、右歸丸”含藥血清具備明顯促進骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨分化。(3)補腎經(jīng)典方“左、右歸丸”含藥血清能通過上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨基因osterix、oc的表達,促進骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)向成骨方向分化的作用。(4)補腎經(jīng)典方“左、右歸丸”能通過調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨基因osterix、oc啟動子區(qū)域低甲基化的表觀遺傳學機制,起促進骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨方

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