左歸丸、右歸丸對β-catenin、Runx2調(diào)控BMSCs成骨分化及其甲基化的影響.pdf

1、目的:本實驗研究左歸丸、右歸丸SD大鼠含藥血清在成骨誘導(dǎo)環(huán)境中的不同時間點干預(yù)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨分化過程中，成骨靶基因β-catenin（β-鏈蛋白）、Runx2（成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子2）的表達情況及其甲基化水平情況。以此闡明“腎主骨”的物質(zhì)基礎(chǔ)（主要）為骨髓間充質(zhì)干細胞;功能基礎(chǔ)（主要）為靶基因β-catenin、Runx2甲基化調(diào)控成骨分化，為治療骨質(zhì)疏松、骨壞死等疾病提供新的方法，也為中醫(yī)“腎主骨”理論的創(chuàng)新提供

2、新的思路。
　　方法:以3周齡(40g±5g) SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞為研究對象，采用貼壁篩選法和密度梯度離心法相結(jié)合的方法進行體外分離、純化、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞。通過細胞形態(tài)學(xué)觀察及流式細胞技術(shù)的方法鑒定BMSCs。在對BMSCs進行傳代純化的基礎(chǔ)上，制備左歸丸、右歸丸SD大鼠含藥血清進行干預(yù)誘導(dǎo)，以成骨基因β-catenin、Runx2為靶基因，采用實時熒光定量PCR(Real time RT-PCR)、甲基化特異性PCR

3、(MSP)等核心實驗技術(shù)檢測在成骨誘導(dǎo)條件下干預(yù)7天后（3天的實驗研究前期已完成），觀察靶基因β-catenin、Runx2的表達情況及其甲基化規(guī)律。
　　結(jié)果:(1)通過對體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞進行流式細胞技術(shù)鑒定，細胞表面標(biāo)記物為CD29陽性，CD90陽性，CD34陰性，CD45陰性，表達BMSCs表面標(biāo)記物而不表達其它造血系干細胞等的標(biāo)記物，符合骨髓間充質(zhì)干細胞特性，證實所研究的細胞為來源于骨髓的骨髓間充質(zhì)干細胞。(

4、2)在成骨誘導(dǎo)環(huán)境中，含藥血清干預(yù)7天后，經(jīng)Real time RT-PCR檢測，結(jié)果為:左歸丸組、右歸丸組誘導(dǎo)β-catenin基因的表達明顯高于正常對照組、成骨誘導(dǎo)組，組間比較差異明顯(P＜0.05)。左歸丸組、右歸丸組誘導(dǎo)的Runx2基因的表達明顯高于正常對照組、成骨誘導(dǎo)組，組間比較差異明顯(P＜0.05)。(3)在成骨誘導(dǎo)環(huán)境中，含藥血清干預(yù)7天后，經(jīng)甲基化特異性PCR檢測，結(jié)果為:左歸丸組、右歸丸組β-catenin基因甲基化

5、率明顯低于成骨誘導(dǎo)組、正常對照組，組間比較差異明顯(P＜0.05)。β-catenin基因甲基化程度依次為右歸丸組＜左歸丸組＜成骨誘導(dǎo)組＜正常對照組。左歸丸組、右歸丸組Runx2基因甲基化率明顯低于成骨誘導(dǎo)組、正常對照組，組間比較差異明顯（P＜0.05）。Runx2基因啟動子區(qū)域甲基化程度依次為左歸丸組＜右歸丸組＜成骨誘導(dǎo)組＜正常對照組。
　　結(jié)論:(1)左歸丸、右歸丸具有促進成骨的作用。(2)左歸丸、右歸丸通過上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細