T細胞免疫衰老對破骨細胞增殖分化的影響及右歸丸的逆轉效應.pdf

1、目的：
　　隨著老齡化社會的到來，自身免疫病、骨代謝性疾病等免疫衰老相關疾病已成為威脅老年健康的重要因素，骨代謝異常引發(fā)的骨破壞是免疫衰老相關疾病的重要特征之一。減低這類疾病的危害，必需重視改善免疫衰老狀態(tài)。T細胞亞群失衡是免疫衰老的核心，增齡與炎癥刺激的日積月累使T細胞表型與功能的多樣性、可塑性和均衡性受到破壞，并直接威脅骨免疫內環(huán)境的穩(wěn)定，造成破骨細胞（Osteoclast，OC）的異?；罨凸橇縼G失，導致骨代謝性疾病，如骨質

2、疏松癥及炎癥性骨丟失等。因此，保護T細胞庫的多樣性和可塑性、重建T細胞亞群平衡可恢復免疫內環(huán)境穩(wěn)定、改善骨微環(huán)境，防治骨代謝疾病。
　　我們以往在研究發(fā)現：右歸丸(You-Gui-Wan, YGW)及部分有效成分可調節(jié)T細胞亞群分化發(fā)育和效應極化，對由激素誘導的T細胞免疫衰老有明顯的保護作用，部分成分可提高初始T細胞含量，提高機體對抗新抗原刺激的能力。這些藥物在逆轉T細胞異常分化的同時是否能改善破骨細胞的異常分化是我們關注的焦點。

3、在此基礎上，探討T細胞的免疫衰老程度與骨代謝異常的相關性，并以YGW及部分有效成分的保護效應機制為依據，尋找抗T細胞免疫衰老、防治骨代謝疾病的藥理機制和藥效物質基礎，為中醫(yī)藥改善免疫衰老、防治骨相關疾病提供新策略。
　　方法：
　　1.中藥YGW制劑的制備：根據YGW經典配方組成配伍中藥，采用傳統水提醇沉方法制備該復方制劑。YGW部分有效成分選用君臣藥物的有效成分烏頭堿（aconitine, AC）、梓醇（catapol,

4、CA）、桂皮醛（cinnamaldehyde, CI）。
　　2. T細胞免疫衰老模型的建立及中藥制劑的干預方法：采用激素法誘導建立T細胞免疫衰老小鼠模型；模型小鼠的中藥治療分為四組，分別采用腹腔注射CA組(6mg·kg-)、CI組(0.126mg·kg-)、AC組(10μg·kg-)和YGW組(7.5g·kg-)灌胃治療組。
　　3.采用Annexin V/PI雙染法檢測各組小鼠胸腺細胞凋亡狀態(tài)。
　　4.流式細胞術

5、檢測小鼠外周血、脾臟、骨髓中初始 T細胞（ na?ve T cell, Tn, CD3+CD45RA+CD62L+）和中央型記憶性 T細胞（ central memory T cell, TCM:CD3+CD44hiCD45RA+CD62L+）效應性記憶 T細胞（effector memory T cell, TEM:CD3+CD44hiCD45RA+CD62L-）比例，分析CD4+/CD8+的變化。
　　5.采用流式細胞胞內外因

6、子雙染法檢測 T細胞亞群 Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)、Th2(CD3+CD4+IL-4+)、Th17(CD3+CD4+IL-17+)及Treg(CD4+CD25+foxp3+)的效應極化狀態(tài)及RANKL（CD3+RANKL+）的表達。
　　6.采用HE染色觀察小鼠骨形態(tài)學變化，
　　7. ELISA法檢測小鼠血清中破骨細胞活性相關TRACP5b的表達水平
　　8. Western blot技術檢測藥物處理前

7、后骨髓細胞TRAF6、P38、MEK等破骨細胞分化相關信號分子的表達水平。
　　9. MTT法檢測激素處理前后破骨細胞的增殖能力以及右歸丸及部分有效成分的直接作用。
　　10. RT-PCR技術檢測破骨細胞RANK、NFATc1 mRNA的表達水平，以及右歸丸及部分有效成分的直接作用。
　　結果：
　　1.激素誘導小鼠T細胞免疫衰老狀態(tài)
　　激素誘導的衰老模型小鼠胸腺細胞數量明顯減少(P<0.05)，胸腺細

8、胞凋亡率升高(P<0.01)；外周血、脾臟、骨髓中Tn比例下降(P<0.05)； TCM比例降低(P<0.05)，而效應記憶T細胞(TEM)比例上升(P<0.05)；CD4/CD8的比值降低(P<0.05)； Th1細胞亞群分泌IFNr的能力下降、Th2比例無明顯變化、Th17比例升高、Treg細胞比例降低，Th1/Th2的比值下降、Th17/Treg比值升高(P<0.05)；T細胞亞群處于失衡狀態(tài)，是激素誘導T細胞免疫衰老的典型模式。

9、
　　2.激素誘導小鼠T細胞免疫衰老狀態(tài)對骨代謝的影響
　　伴隨著T細胞亞群的改變，骨髓細胞明顯減少，骨髓微環(huán)境中Tn減少，Th1細胞比例下降，而Th17比例升高，T淋巴細胞RANKL表達升高，骨組織骨陷窩增大，骨小梁面積減少(P<0.05)；并且血清中破骨細胞相關抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP5b）水平顯著升高(P<0.05)，T細胞亞群失衡與骨代謝異常伴隨發(fā)生。
　　3.右歸丸及部分有效成分顯著逆轉激素誘導的T

10、細胞免疫衰老狀態(tài)
　　與激素誘導的衰老模型小鼠相比，YGW及部分有效成分可明顯抑制小鼠胸腺細胞的的過度凋亡、提高外周免疫器官Tn的比例(P<0.05)；TCM比例升高(P<0.05)，TEM比例相對下降(P<0.05)；上調CD4/CD8細胞的比值，增強脾臟Th1亞群細胞IFN-γ的分泌能力，上調Th1/Th2比值，(P<0.05)，降低Th17亞群細胞比例，而調節(jié)性Treg細胞亞群比例有所升高，使Th17/Treg比值有所恢復(

11、P<0.05)，改善了激素誘導的T細胞亞群失衡狀態(tài)。
　　4.右歸丸及部分有效成分顯著逆轉骨髓微環(huán)境中T細胞亞群失衡
　　與激素誘導的衰老模型小鼠相比， YGW及部分有效成分可提高骨髓 Tn的比例(p<0.05)；增強骨髓 Th1亞群細胞 IFN-γ的分泌能力，降低 Th17亞群細胞比例，降低RANKL的表達，逆轉骨微環(huán)境中激素誘導的T細胞亞群失衡狀態(tài)。
　　5.右歸丸及部分有效成分對激素誘導骨代謝異常的保護作用

12、>　　骨組織HE染色結果顯示：YGW及其有效成分均能抑制激素誘導的骨小梁的面積減少，保護激素誘導的骨丟失，同時，降低血清中TRACP5b的表達水平。TRAF6分子的表達(P<0.05)，減弱MAPK信號通路的活化，從而抑制破骨細胞的成熟。
　　6.右歸丸及部分有效成分體外對激素誘導的破骨細胞異常分化的直接作用
　　MTT結果顯示：YGW及部分有效成分能夠明顯抑制破骨細胞的增殖，藥效呈時間劑量依賴性；同時，高濃度 YGW及部分

13、有效成分能夠降低破骨細胞分化特異性基因RANK、NFATc1 mRNA的表達水平。
　　結論：
　　1.激素誘導的T細胞免疫衰老狀態(tài)突出特征是：Tn、TCM細胞的比例降低，TEM細胞比例相對升高，CD4/CD8、Th1/Th2、Th17/Treg亞群之間的比例失衡，骨髓T細胞RANKL表達升高。
　　2.右歸丸及部分有效成分對激素誘導的 T細胞免疫衰老有明顯的保護作用，可顯著提高Tn、TCM細胞的比例，降低TEM細胞比

14、例，重建脾臟和骨微環(huán)境CD4/CD8、Th1/Th2、Th17/Treg各亞群之間的平衡，同時降低骨髓T細胞RANKL的表達。
　　3.右歸丸及部分有效成分能夠降低血清中TRACP5b的表達，抑制激素誘導的破骨細胞骨吸收活性的增強，改善骨質。
　　4.右歸丸及部分有效成分逆轉T細胞免疫衰老誘導的OC異常分化其作用機制可能是通過抑制MAPK信號通路中MEK和P38的活化，從而抑制了OC的分化和成熟。
　　5.右歸丸及部分