小鼠MafB過(guò)表達(dá)對(duì)單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建小鼠MafB（ v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family, protein B）基因重組腺病毒表達(dá)載體，闡明MafB對(duì)小鼠破骨細(xì)胞分化的影響。并對(duì)破骨細(xì)胞的分化如何被MafB影響機(jī)制作一研究。
　　方法：1.提取小鼠RAW264.7細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板RT-PCR獲得含SalⅠ/EcoRⅤ雙酶切位點(diǎn)的目的基因MafB，經(jīng)限制性內(nèi)切

2、酶作用后與穿梭質(zhì)粒 pAdTrack-CMV鏈接，經(jīng)酶切鑒定正確的穿梭質(zhì)粒用 PmeⅠ線性化后轉(zhuǎn)化到含 pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183菌株中同源重組成腺病毒載體pAd-MafB，經(jīng)PacⅠ線性化后，在HEK293細(xì)胞中包裝腺病毒 Ad-MafB，感染小鼠RAW264.7細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、空載體組（Ad-GFP組）和過(guò)表達(dá)組（Ad-MafB組），經(jīng)RT-PCR和Western blotting檢測(cè)MafB的表達(dá)水平，證明

3、細(xì)胞內(nèi)有無(wú)MafB的過(guò)表達(dá)。
　　2.RT-PCR和Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)MafB對(duì)成熟破骨細(xì)胞標(biāo)志物抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate Resistant Acid Phosphatase, TRAP）與組織蛋白酶K（cathepsin K,CTSK）的影響。
　　3.RT-PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)MafB時(shí)，破骨細(xì)胞分化關(guān)鍵因子活化T細(xì)胞核因子c1（nuclear factor of activat

4、ed T cells c1,NFAT c1）和破骨細(xì)胞相關(guān)受體（osteoclast-associated receptor,OSCAR）的表達(dá)水平。
　　4.經(jīng)抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法觀察 MafB對(duì)小鼠可溶性核因子κB受體活化因子配體( receptor activator of NF-κB ligand, sRANKL)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的影響。
　　5.通過(guò)構(gòu)建小鼠顱骨骨片體外溶骨模型，經(jīng)電鏡掃描分析破骨細(xì)

5、胞溶骨特性的變化情況。
　　結(jié)果：1.成功構(gòu)建了重組腺病毒 Ad-MafB，可感染小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW264.7，RT-PCR和Western blotting結(jié)果均顯示與空白對(duì)照組和Ad-GFP組比較，Ad-MafB組RAW264.7細(xì)胞MafB mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)且蛋白相對(duì)表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。
　　2.RT-PCR和Western blotting結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和Ad-GFP組比較，Ad-MafB

6、組TRAP及CTSK mRNA表達(dá)減弱且蛋白相對(duì)轉(zhuǎn)錄及翻譯水平顯著降低（P＜0.05）。
　　3.通過(guò)RT-PCR對(duì)破骨細(xì)胞分化關(guān)鍵因子分析發(fā)現(xiàn)，Ad-MafB組破骨細(xì)胞分化的最主要的轉(zhuǎn)錄因子NFAT c1及OSCAR表達(dá)明顯受抑制（P＜0.05）。
　　4.TRAP染色，Ad-MafB組TRAP陽(yáng)性的多核巨細(xì)胞明顯少于Control組和Ad-GFP組。
　　5.成功構(gòu)建小鼠顱骨骨片體外溶骨模型，電鏡掃描發(fā)現(xiàn)在RAW2