c-Maf基因過(guò)表達(dá)對(duì)軟骨細(xì)胞分化和下游基因表達(dá)的影響.pdf

1、研究目的：探索c-maf基因在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中過(guò)表達(dá)對(duì)軟骨細(xì)胞分化和下游基因表達(dá)的影響，進(jìn)而推測(cè)它在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中所起的作用。 研究方法： 取5-6日齡BALB/c小鼠的髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)軟骨培養(yǎng)后觀察細(xì)胞形態(tài)，并用免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)Ⅱ型膠原的表達(dá)。利用E Coli DH5 α菌株表達(dá)帶有c-maf-gfp基因或e3p基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染EcoPack2<'TM>-293細(xì)胞，制備帶有c-maf-gfp基因或gr

2、p基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，分別用離心感染(SPINinfection)的方法轉(zhuǎn)化軟骨細(xì)胞。24小時(shí)后使用流式細(xì)胞儀分離被轉(zhuǎn)化和沒(méi)有被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，分別提取mRNA，用實(shí)時(shí)RT-PCR(Real time RT-PCR)方法測(cè)定下游基因的表達(dá)。同時(shí)分別在24孔板中接種分離后的細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后用熒光顯微鏡觀察c-maf基因過(guò)表達(dá)對(duì)軟骨細(xì)胞形態(tài)變化的影響。 研究結(jié)果： 培養(yǎng)72小時(shí)后的原代軟骨細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈橢圓形或多邊形，免疫組

3、織化學(xué)檢測(cè)95％以上的細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EcoPack2-293細(xì)胞和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化軟骨細(xì)胞的效率分別達(dá)到80-90％及50-60％。培養(yǎng)48小時(shí)后，熒光顯微鏡觀察c-maf基因過(guò)表達(dá)的軟骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，扁平、有多個(gè)偽足，而對(duì)照組的軟骨細(xì)胞則仍然保持原代細(xì)胞的形態(tài)特征。實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MMP-13和MMP-3在c-maf基因過(guò)表達(dá)的軟骨細(xì)胞中表達(dá)顯著增高，而Co12的表達(dá)則明顯下降。 研究結(jié)論： 利用逆