氟對體外培養(yǎng)的成骨細胞中Ras基因表達的影響.pdf

1、目的：在驗證及改良小鼠成骨細胞原代培養(yǎng)常用方法的基礎上，分別從蛋白質(zhì)及其mRNA表達水平檢測不同劑量氟對小鼠成骨細胞中Ras基因的影響；同時檢測不同劑量氟對人成骨細胞中RasmRNA表達量的影響。 方法：建立與改良小鼠成骨細胞的原代培養(yǎng)方法，通過堿性磷酸酶和鈣結(jié)節(jié)染色方法進行細胞來源鑒定；染氟劑量分別為：0mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L和20mg/L；利用免疫組化、原位雜交、免疫印記和RT-PCR(rever

2、se transcri ption polymerase chain reaction)的方法檢測染氟后小鼠成骨細胞中Ras蛋白及mRNA表達水平；采用Real Time RT-PCR的方法測定染氟后人成骨細胞內(nèi)RasmRNA表達量的變化。 結(jié)果：改良后的細胞培養(yǎng)方法重復性好、成骨細胞生長穩(wěn)定、純化效果好，完全適和建立氟中毒的體外模型。小鼠成骨細胞染氟10天后，免疫組化和原位雜交結(jié)果顯示：對照組、2.5mg/L染氟組及5.0mg

3、/L染氟組成骨細胞中Ras基因均有較強陽性表達，但10.0mg/L、20.0mg/L染氟組的成骨細胞Ras基因則為弱陽性表達；2.5mg/L組與對照組比較，2.5mg/L組的陽性強度高于對照組，表達范圍也明顯大于對照組；而其余各染氟組與對照組比較，陽性強度低于對照組，表達范圍也明顯小于對照組。陽性細胞計數(shù)結(jié)果顯示：各染氟組陽性表達細胞數(shù)與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，2.5mg/L染氟組高于對照組，其它染氟組低于對照組；2.5

4、mg/L和5.0mg/L染氟組陽性細胞數(shù)高于其它染氟組(P<0.05)，2.5mg/L組陽性細胞數(shù)最高。小鼠成骨細胞的RasmRNA相對定量結(jié)果顯示：2.5mg/L染氟組高于對照組，其它染氟組均少于對照組；同時2.5mg/L染氟組大于其它染氟組；染氟組的RasmRNA相對定量有隨著劑量增加而逐漸降低的趨勢。小鼠成骨細胞的Ras蛋白相對定量結(jié)果顯示：2.5mg/L與5.0mg/L染氟組蛋白相對定量大于對照組，其它染氟組均小于對照組；同時，

5、5mg/L染氟組蛋白相對定量大于其它染氟組。人成骨細胞中RasmRNA相對定量顯示：2.5mg/L及以上劑量氟作用下人的成骨細胞中RasmRNA相對定量小于對照組。 結(jié)論：氟作用于小鼠成骨細胞后可以影響小鼠成骨細胞的Ras基因蛋白及mRNA的表達，表現(xiàn)為雙向作用即低劑量的氟對Ras基因蛋白及mRNA表達有促進作用，高劑量的氟抑制Ras基因蛋白及mRNA表達。氟作用于人成骨細胞后可以影響人成骨細胞的RasmRNA的表達，本實驗劑量