不同頻率的機(jī)械振動(dòng)與IL-1β對(duì)兔軟骨細(xì)胞基因表達(dá)的作用.pdf

1、目的：骨性關(guān)節(jié)炎是好發(fā)于老年人的常見的復(fù)雜的關(guān)節(jié)疾病,為關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變,有許多病理途徑及因素影響其病理進(jìn)程。因此,為弄清疾病進(jìn)程中的不同階段,有哪些信號(hào)被激活,仍需要做大量的研究工作。目前認(rèn)為分子(如IL-1β)及機(jī)械刺激兩方面的因素影響著關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。這個(gè)連續(xù)的進(jìn)程被暫時(shí)的、自分泌及旁分泌因素所打斷,這個(gè)病理進(jìn)程通過共同的病理途徑,該途徑涉及到細(xì)胞因子(IL-1β,TNFα),信號(hào)調(diào)停者(NO,PGE2,ROS),機(jī)械

2、敏感基因(iNOS,COX-2,MMPs),MAPKs(p38、JNK、ERK1/2),轉(zhuǎn)錄因子(NFKB,AP-1)。機(jī)械刺激能開放半通道、引起ATP的釋放,作為軟骨細(xì)胞機(jī)械傳導(dǎo)途徑中的一部分。
　　 關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨組織,在關(guān)節(jié)的正常活動(dòng)中,總是受到一定的機(jī)械壓力,合適強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)壓力有利于軟骨細(xì)胞的合成代謝,而靜態(tài)壓力使關(guān)節(jié)軟骨退變。機(jī)械壓力有不同的作用形式,包括流體剪切、壓縮、拉伸,這些可能影響軟骨細(xì)胞中由IL-1β激活

3、的信號(hào)傳導(dǎo)通路。IL-1β作為骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的一種分子因素,是由有炎癥的關(guān)節(jié)中的滑膜細(xì)胞與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子,它能抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成,促進(jìn)細(xì)胞老化。
　　 本文研究在有或無炎癥介質(zhì)IL-1β存在的情況下,軟骨細(xì)胞在不同頻率振動(dòng)刺激下的不同反應(yīng),即軟骨細(xì)胞的合成與分解代謝基因的不同表達(dá),從而了解機(jī)械振動(dòng)對(duì)不同狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞的作用。因此,生化及機(jī)械交叉誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑為預(yù)防骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生提供治療策略,為細(xì)胞修復(fù)提供新的方

4、法。
　　 材料與方法：從兩個(gè)月大小的新西蘭兔的多個(gè)關(guān)節(jié)中獲得軟骨細(xì)胞,在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng),待軟骨細(xì)胞大致長滿瓶底后(約2—3天),換液1次,將一半的孔中加入10ng/mlIL-1β(Peprotech Asia,USA),次日應(yīng)用自制復(fù)合振動(dòng)儀,將振動(dòng)強(qiáng)度O.5 g(g為加速度),不同頻段0、45、90 Hz振動(dòng)應(yīng)變分別作用于軟骨細(xì)胞,30mins/d,應(yīng)用自制復(fù)合振動(dòng)儀,振動(dòng)強(qiáng)度為0.5 g(g為加速度),使用三種不同的機(jī)械

5、振動(dòng)頻率(0、45、90Hz)分別作用于培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞。此時(shí),分子因素IL-1β與機(jī)械振動(dòng)共同刺激下的兔軟骨細(xì)胞可分成A—F六組:其中A表示IL-Vib-組,B代表IL+Vib-組,C表示IL-Vib45+組,D表示IL+Vib45+組,E表示IL-Vib90+組,F表示IL+Vib90+組。振動(dòng)培養(yǎng)兩天,末次振動(dòng)后繼續(xù)在細(xì)胞孵箱中放置1小時(shí)后,用RT—PCR檢測軟骨細(xì)胞中Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、iNOS、COX-2、Aggrecan基因

6、表達(dá)產(chǎn)量,RT—PCR即從兔軟骨細(xì)胞中提取總RNA并合成cDNA。用TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)嚴(yán)格按說明書操作抽提總RNA測定濃度和純度。PCR循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性5分鐘,95℃變性15秒,60℃退火15秒。72℃32秒,并采集熒光信號(hào),40個(gè)循環(huán)。在PCR反應(yīng)結(jié)束后,設(shè)定基線水平和閾值,ABI7500軟件會(huì)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本的基因及管家基因的絕對(duì)拷貝數(shù),從而可得出各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)

7、量。結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One—Way ANOVA),用LSD法對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較,若經(jīng)Levene檢驗(yàn),數(shù)據(jù)不滿足方差齊性,則采用方差分析的近似方法Dunnett T3法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。p<0.05看作是有顯著性差異。
　　 結(jié)果與結(jié)論：在未給予炎性介質(zhì)和或機(jī)械振動(dòng)刺激下,正常兔軟骨細(xì)胞有大量的Aggrecan、Ⅱ型膠原基因的表達(dá),一定量的Ⅰ型膠原基因表達(dá),同時(shí)也有少量的iNOS mRNA

8、與COX-2 mRNA表達(dá)。未給予機(jī)械振動(dòng)刺激的前提下,10ng/ml的炎癥介質(zhì)IL-1β使軟骨細(xì)胞中的iNOS、COX-2基因表達(dá)顯著升高,使細(xì)胞中Ⅱ型膠原、Ⅰ型膠原、Aggrecan基因產(chǎn)量下降。
　　 無炎性介質(zhì)IL-1β的參與的情況下,頻率為45HZ與90HZ的機(jī)械振動(dòng)抑制兔軟骨細(xì)胞中Aggrecan基因的表達(dá)(p<0.05),頻率為45HZ與頻率為90HZ的機(jī)械振動(dòng)對(duì)軟骨細(xì)胞Aggrecan基因表達(dá)的影響無顯著差異(p

9、>0.05)。相對(duì)于對(duì)照組,頻率為45HZ、90HZ的機(jī)械振動(dòng)對(duì)軟骨細(xì)胞COX-2與iNOS基因的表達(dá)均無顯著影響(p>0.05)；同時(shí)這兩種頻率對(duì)軟骨細(xì)胞COX-2與iNOS基因的表達(dá)上進(jìn)行相互比較,也未發(fā)現(xiàn)顯著差異(p>0.05)。頻率為45HZ的機(jī)械振動(dòng)抑制Ⅰ型膠原基因的表達(dá)(p<0.05)；相對(duì)于頻率為45HZ的振動(dòng),90HZ的機(jī)械振動(dòng)促進(jìn)Ⅰ型膠原的表達(dá)(p<0.05)。在無IL-1β的參與下,與對(duì)照組相比,45HZ的機(jī)械振動(dòng)對(duì)

10、Ⅱ型膠原的表達(dá)無顯著影響(p>0.05),而90HZ的機(jī)械振動(dòng)能顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原基因的表達(dá)(p<0.05)。
　　 在濃度為10ng/ml炎性介質(zhì)L-1β存在的條件下,相對(duì)于OHZ頻率,45HZ的機(jī)械振動(dòng)抑制軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原與Aggrecan基因的表達(dá)(p<0.05),90HZ的機(jī)械振動(dòng)對(duì)軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原與Aggrecan基因的表達(dá)無顯著影響(p>0.05)。而相對(duì)與45HZ的振動(dòng)頻率,90HZ的機(jī)械振動(dòng)對(duì)Ⅱ型膠原

11、基因表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用(p<0.05)。IL-1β存在的條件下,45HZ與90HZ頻率的機(jī)械振動(dòng)能抑制iNOSmRNA、COX-2 mRNA的表達(dá)(p<0.05)。但45HZ與90HZ這兩種頻率的機(jī)械振動(dòng)對(duì)iNOS基因的表達(dá)量無顯著差異(p>0.05)。對(duì)于抑制COX-2mRNA的表達(dá)而言,與45HZ的機(jī)械振動(dòng)相比,頻率為90HZ的機(jī)械振動(dòng)更能抑制COX-2基因表達(dá),其表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生更少(p<0.01)；相對(duì)于OHZ,45HZ或90HZ

12、的機(jī)械振動(dòng)對(duì)Ⅰ型膠原基因表達(dá)無顯著影響(p>0.05),45HZ與90HZ的機(jī)械振動(dòng)之間對(duì)產(chǎn)物的抑制無顯著差別(p>0.05)。
　　 與此同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)不管有無IL-1β的參與,隨著機(jī)械振動(dòng)頻率的升高,軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原與Aggrecan表達(dá)產(chǎn)物均有升高的趨勢。
　　 本試驗(yàn)提示炎癥介質(zhì)IL-1β能使兔軟骨細(xì)胞老化,合適頻率的機(jī)械振動(dòng)能促進(jìn)特定環(huán)境中細(xì)胞的合成,抑制軟骨細(xì)胞的去分化,從而為預(yù)防骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生提供治療策