杜仲苷對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞分解代謝和凋亡的影響及其作用機制.pdf

1、目的：
　　本研究通過構(gòu)建IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞炎癥模型，利用杜仲苷對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞進行干預(yù)，從基因和分子水平研究杜仲苷對軟骨細胞分解代謝及凋亡的影響情況，從而進一步研究其作用機制和傳導(dǎo)通路。為中藥單體化合物治療OA提供實驗證據(jù)，從而為下一步治療骨性關(guān)節(jié)炎提供一種新的方法。
　　方法：
　　1.大鼠軟骨細胞的培養(yǎng)
　　無菌條件下切除SD大鼠雙側(cè)后肢，用眼科剪和刀片削下膝關(guān)節(jié)軟骨組織，用37℃的PBS緩

2、沖液沖洗剪下來的軟骨組織2～3次。將軟骨組織移至離心管，加入1ml0.25％胰蛋白酶，用眼科剪將滑膜組織剪成1mm4的塊狀組織。再加入2ml胰酶放入37℃孵箱30min，期間震蕩1-2次。拿出離心2000rmp，5min，將上層液體倒掉，用0.2％的Ⅱ型膠原酶消化2h，期間震蕩4-5次，然后離心2000rmp，5min，去除上清，根據(jù)軟骨組織塊的大小及含量的多少加入適量的DMEM完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清和青、鏈霉素各10萬/L雙抗液

3、體），晃動，攪勻。
　　2.軟骨細胞鑒定
　　倒置相差顯微鏡觀察:在軟骨細胞分離、培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)的各個時期通過倒置相差顯微鏡觀察正常軟骨細胞的形態(tài)、貼壁生長情況、生長特性及細胞密度，在軟骨細胞的原代，一代，二代分別觀察拍照。
　　阿爾新藍染色:用PBS溶液輕輕清洗細胞，去掉全培溶液。然后用4％多聚甲醛固定30min。加入1％的阿爾新藍溶液，染色過夜，用DH2O漂洗數(shù)次，直至無色，拿到顯微鏡下觀察拍照。
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4、膠原免疫組織化學(xué)染色:取一到三代的軟骨細胞滴在蓋玻片上，使用爬片技術(shù)，待細胞基本生長成單層后，取出蓋玻片，以4％多聚甲醛固定20min。3％過氧化氫室溫下孵育10min，PBS緩沖液沖洗3次，每次5min，滴加正常非免疫動物血清室溫下孵育10min。然后除去血清，滴加1∶100兔抗-大鼠Ⅱ型膠原一抗，4℃過夜。PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。滴加生物素標記的二抗，室溫下孵育10min，PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。DAB顯色，

5、蘇木精復(fù)色，無水乙醇脫水，中性樹膠封片。正置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。
　　3.杜仲苷對軟骨細胞增殖和毒性作用的測定
　　將軟骨細胞接種于96孔板內(nèi)，用1、10、20、50μM的杜仲苷以及完全培養(yǎng)基DMEM刺激24，48小時。用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測定細胞增殖和細胞毒性。
　　4.杜仲苷對白細胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞炎癥及分解代謝作用的影響
　　將軟骨細胞接種于6孔板中，用1

6、、10、20、50μM的杜仲苷及完全培養(yǎng)基DMEM刺激30分鐘，隨后加入10 ng/ml白細胞介素-1β(IL-1β)24小時。
　　5.用Western blot檢測IL-1β誘導(dǎo)下軟骨細胞中，IKK、IBα及胞核NF-κB亞基p65的磷酸化及表達情況，確定NF-κB通路被激活的最強時間點，進而探討杜仲苷對IL-1β激活NF-κB通路的作用機制。
　　6.用Western blot檢測不同濃度杜仲苷對IL-1β誘導(dǎo)下軟骨細

7、胞內(nèi)IKK、IκBα及NF-κB亞基p65的磷酸化表達情況。用免疫熒光(Immunofluorescence microscopy)檢測不同濃度杜仲苷對IL-1β誘導(dǎo)下軟骨細胞內(nèi)NF-κB亞基p65核轉(zhuǎn)移的情況。
　　7.在熒光酶標儀或共聚焦顯微鏡下用熒光探針二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)檢測杜仲苷是否抑制IL-1β的刺激下軟骨細胞產(chǎn)生的ROS。
　　8.杜仲苷對白細胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡的影響
　　將軟

8、骨細胞接種于6孔板中，用1、10、20、50μM的杜仲苷及完全培養(yǎng)基DMEM刺激30分鐘，隨后加入10ng/ml白細胞介素-1β(IL-1β)培養(yǎng)24小時。收集細胞，加入帶有綠色熒光的熒光探針FITC標記的AnnexinV及碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色液，利用流式細胞儀來檢測軟骨細胞凋亡百分比。
　　9.利用Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3及C

9、leavedCaspase-9表達情況。
　　統(tǒng)計學(xué)分析:
　　所有實驗均重復(fù)3次，每個實驗指標取這些數(shù)據(jù)的平均值，以均數(shù)±標準差表示，所有統(tǒng)計結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS16.0完成。
　　結(jié)果:
　　1.杜仲苷在一定濃度范圍內(nèi)對軟骨細胞無毒性作用:
　　CCK8結(jié)果顯示，杜仲苷在一定濃度范圍(1、10、20、50μM)對軟骨細胞沒有顯著的毒性作用。不同濃度杜仲苷對軟骨細胞的活力影響，采用One-WayANO

10、VA進行統(tǒng)計分析，Levene's Test方法檢測軟骨細胞中加入不同濃度杜仲苷得出OD值總體方差齊性(P=0.287)。
　　2.杜仲苷抑制白細胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞炎癥及分解代謝
　　RT-PCR結(jié)果顯示在10ng/ml IL-1β刺激下軟骨細胞內(nèi)的MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS、COX-2的mRNA水平顯著提高，與加入培養(yǎng)基的對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。基于方差齊性的方差分析結(jié)果表明，其

11、余組與IL-1β組比較，軟骨細胞中上述基因的表達有統(tǒng)計學(xué)差異。Griess Reagent結(jié)果顯示在10ng/ml IL-1β刺激下NO產(chǎn)生同樣增多，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)?；诜讲铨R性的方差分析結(jié)果表明與IL-1β組比較，其余組NO產(chǎn)生水平有統(tǒng)計學(xué)差異(F=21.297，P＜0.001，表1-7)，隨著濃度的增高抑制的程度隨之增強。
　　Western blot結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果相似，在10ng/ml IL

12、-1β刺激下軟骨細胞內(nèi)MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS、COX-2的蛋白水平也顯著提高，伴隨著加入杜仲苷濃度的增加，軟骨細胞內(nèi)的MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS、COX-2蛋白表達也逐漸被抑制，加入50μM杜仲苷的抑制作用最為明顯。
　　3.杜仲苷抑制白細胞介素-1β刺激的軟骨細胞內(nèi)NF-κB的激活
　　在IL-1β的刺激作用下，隨著時間變化(0、0.5、1、2、6h)，NF-κB通路逐漸被激活而

13、后恢復(fù)，軟骨細胞內(nèi)的NF-κB系統(tǒng)內(nèi)的IκBα逐漸降解，IKK磷酸化，而NF-κB的亞基p65的磷酸化程度逐漸增高，在2小時達到高峰，6小時后下降，正常組無此效應(yīng)。IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞NF-κB系統(tǒng)激活的效應(yīng)能夠被杜仲苷(1、10、20、50μM)所抑制，隨著加入的不同濃度(1、10、20、50μM)，抑制作用逐漸增強，在50μM濃度下，作用最為明顯。
　　免疫熒光結(jié)果顯示，在IL-1β的刺激作用下，熒光標記的NF-κB的亞基p

14、65從細胞胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，NF-κB通路被激活。被IL-1β刺激的軟骨細胞，加入杜仲苷后熒光標記的p65多數(shù)存在于細胞漿內(nèi)而非細胞核內(nèi)，證明了IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞NF-κB系統(tǒng)激活的效應(yīng)能夠被杜仲苷所抑制。
　　4.杜仲苷降低白細胞介素-1β誘導(dǎo)軟骨細胞內(nèi)活性氧族(ROS)水平
　　共聚焦顯微鏡下顯示IL-1β能夠顯著提升軟骨細胞內(nèi)的熒光強度，與單純培養(yǎng)基對照組比有顯著的差異。而加入杜仲苷組軟骨細胞內(nèi)熒光強度明顯減弱

15、，提示杜仲苷能夠顯著降低IL-1β提升軟骨細胞ROS的水平。采用One-WayANOVA進行統(tǒng)計分析，Levene's Test方法檢測軟骨細胞中加入不同濃度杜仲苷和IL-1β得出ROS水平總體方差齊性(P=0.885)?；诜讲铨R性的方差分析結(jié)果表明，與IL-1β組相比，加入50μM杜仲苷的軟骨細胞中ROS水平具有統(tǒng)計學(xué)差異意義(F=6.003，P=0.005，表2-2)。
　　5.杜仲苷抑制白細胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡<

16、br>　　流式細胞檢測結(jié)果顯示IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡，加入不同濃度的杜仲苷后，可見軟骨細胞凋亡活性明顯下降，并呈量效關(guān)系。采用One-Way ANOVA進行統(tǒng)計分析，Levene's Test方法檢測軟骨細胞中加入不同濃度杜仲苷和IL-1β得出凋亡率總體方差齊性(P=0.082)。基于方差齊性的方差分析結(jié)果表明，與IL-1β組相比，加入不同濃度杜仲苷的軟骨細胞凋亡率具有統(tǒng)計學(xué)差異意義(F=86.66，P＜0.001，表2-1)。

17、r>　　6.杜仲苷抑制白細胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達
　　在IL-1β刺激下促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9表達水平增高，而同時加入杜仲苷與IL-1β組的軟骨細胞內(nèi)Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達水平有所降低，對于凋亡保護蛋白Bcl-2，IL-1β刺激下并沒有明顯升高，反而下降，在同時加入杜仲苷與IL-1