17-β雌二醇抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　采用白細(xì)胞介素1β(interIeukin-1β IL-1β)建立軟骨細(xì)胞凋亡模型,研究17-β雌二醇在其中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　體外分離培養(yǎng)鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，甲苯胺藍(lán)染色及 II膠原蛋白免疫組化染色鑒定原代培養(yǎng)細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、IL-1β作用組、系列濃度的17-β雌二醇組（系列濃度的17-β雌二醇+50ng/mlrrIL-1β）及雌激素受體阻滯劑組（17

2、-β雌二醇+ICI182780+50ng/mlrrIL-1β），CCK-8發(fā)測(cè)定細(xì)胞存活率,配制不同濃度17-β雌二醇，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit8，CCK-8）檢測(cè)不同濃度17-β雌二醇對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響。Annexin V-FITC/PI熒光染色觀察各組細(xì)胞凋亡，采用RT-PCR方法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、MMP3及MMP13mRNA表達(dá)水平；Western blotting方法檢測(cè)MMP3、

3、MMP13蛋白的表達(dá)水平
　　結(jié)果：
　　分離培養(yǎng)的SD大鼠軟骨細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察大多呈多角形，具有豐富的胞質(zhì)，細(xì)胞核位于胞體中心，少數(shù)可有多個(gè)核仁，原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)10天左右達(dá)到融合狀態(tài)。正常軟骨細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色能使細(xì)胞胞漿呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，大多數(shù)為圓形或橢圓形，可見多個(gè)核仁。CCK-8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比, IL-1β組僅有約40％的生存率，細(xì)胞明顯減少。與IL-1β組相比，17β-E2+ IL-1

4、β組細(xì)胞存活率顯著增加,并呈劑量依賴性。IL-1β組和17β-E2+IL-1β+ICI組之間細(xì)胞存活率沒有明顯變化。通過Annexin V-FITC和PI雙標(biāo)熒光染色顯示 IL-1β誘導(dǎo)組軟骨細(xì)胞凋亡比例較3組不同濃度17β-E2(10-7 M，10-9M,10-11M)+IL-1β組均高。17β-E2+IL-1β+ICI組與IL-1β誘導(dǎo)組相比無顯著差別。RT-PCR方法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因，與對(duì)照組比較， IL-1β誘導(dǎo)后，細(xì)胞Bax表

5、達(dá)升高， Bcl-2表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3組濃度的17β-E2均具有抑制 IL-1β上調(diào) Bax表達(dá)的作用，與IL-1β組和17β-E2+IL-1β+ICI組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn) B組細(xì)胞的 MMP3和MMP13/GAPDH的灰度值明顯大于A和 C組( P＜0.05)，并且D組的MMP3和MMP13/GAPDH的灰度值明顯大于A和 C組( P＜0.05)。
　　結(jié)論：