17-β雌二醇抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　采用白細胞介素1β(interIeukin-1β IL-1β)建立軟骨細胞凋亡模型,研究17-β雌二醇在其中的作用機制。
　　方法：
　　體外分離培養(yǎng)鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，甲苯胺藍染色及 II膠原蛋白免疫組化染色鑒定原代培養(yǎng)細胞為軟骨細胞。實驗分為對照組、IL-1β作用組、系列濃度的17-β雌二醇組（系列濃度的17-β雌二醇+50ng/mlrrIL-1β）及雌激素受體阻滯劑組（17

2、-β雌二醇+ICI182780+50ng/mlrrIL-1β），CCK-8發(fā)測定細胞存活率,配制不同濃度17-β雌二醇，細胞計數(shù)試劑盒8（cell counting kit8，CCK-8）檢測不同濃度17-β雌二醇對軟骨細胞增殖的影響。Annexin V-FITC/PI熒光染色觀察各組細胞凋亡，采用RT-PCR方法檢測凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、MMP3及MMP13mRNA表達水平；Western blotting方法檢測MMP3、

3、MMP13蛋白的表達水平
　　結(jié)果：
　　分離培養(yǎng)的SD大鼠軟骨細胞在倒置相差顯微鏡下觀察大多呈多角形，具有豐富的胞質(zhì)，細胞核位于胞體中心，少數(shù)可有多個核仁，原代軟骨細胞培養(yǎng)10天左右達到融合狀態(tài)。正常軟骨細胞經(jīng)甲苯胺藍染色能使細胞胞漿呈藍色，細胞核呈紫藍色，大多數(shù)為圓形或橢圓形，可見多個核仁。CCK-8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比, IL-1β組僅有約40％的生存率，細胞明顯減少。與IL-1β組相比，17β-E2+ IL-1

4、β組細胞存活率顯著增加,并呈劑量依賴性。IL-1β組和17β-E2+IL-1β+ICI組之間細胞存活率沒有明顯變化。通過Annexin V-FITC和PI雙標熒光染色顯示 IL-1β誘導組軟骨細胞凋亡比例較3組不同濃度17β-E2(10-7 M，10-9M,10-11M)+IL-1β組均高。17β-E2+IL-1β+ICI組與IL-1β誘導組相比無顯著差別。RT-PCR方法檢測凋亡相關(guān)基因，與對照組比較， IL-1β誘導后，細胞Bax表

5、達升高， Bcl-2表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義。3組濃度的17β-E2均具有抑制 IL-1β上調(diào) Bax表達的作用，與IL-1β組和17β-E2+IL-1β+ICI組比較差異均具有統(tǒng)計學意義。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn) B組細胞的 MMP3和MMP13/GAPDH的灰度值明顯大于A和 C組( P＜0.05)，并且D組的MMP3和MMP13/GAPDH的灰度值明顯大于A和 C組( P＜0.05)。
　　結(jié)論：